六聚合酶链反应技术.pptVIP

第五节 聚合酶链反应方法的标准化 PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性。然而正因如此和由于PCR反应过程中所受的人为因素的影响，与以往其他任何一种检验诊断技术相比，其结果都较易受到各种自身和外部因素的影响。所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基本要求并使PCR技术标准化的操作程序已迫在眉睫。 一.PCR实验诊断的基本原则 二.PCR操作程序标准化 （一）上岗人员培训制度 （二）标准化PCR诊断实验室 （三）PCR标准化操作程序 1．试剂配制、分装及保存 2．标本的采集与处理 3．基因扩增及其实验条件的选择 4．扩增产物检测 5．PCR结果的判读 （四）污染的预防及污染源的标准化处理 随着以基因的体外扩增（PCR）技术为核心的疾病基因诊断的发展，临床PCR基因诊断的标准化已受到越来越多的重视。但由于现代分子生物学技术的发展，可用于临床基因检测的技术非常之多，因而在短时间内对以PCR技为主的临床基因诊断（或检测），难以很快形成一个较为完善的和完整的标准化体系或系统。因此聚合酶链反应的标准化过程任重道远，需要我们分子检验工作者共同不懈的努力。 思考题及讨论题 第七章 酸酸分子杂交技术 1、酸酸分子杂交的概念及基本原理。 2、如何制备酸酸探针？ 3、简述Southern Northern 斑点、菌落、原位杂交的步骤。 （二）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 检测RNA病毒、细胞因子mRNA时，一般不能以RNA为模板直接扩增，应用逆转录PCR方法对RNA进行分析可以使敏感性提高几个数量级。原理是先将RNA用逆转录酶逆转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与其他常见PCR方法类似。常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42℃）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37℃），常用的逆转录引物有三种：①随机引物；②Oligo（dT），只适合于3′端带有poly(A)尾的mRNA；③特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。 （三）多重PCR（multiplex PCR） PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率太低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。 多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。 （四）重组PCR（recombinant PCR） 设计两对引物a和b，c和d，引物b、c 5′端有部分碱基互补，并将突变碱基、插入片段、缺失片段或不相邻的两个基因片段的部分碱基设计在引物 b和引物c 5′端序列中。先分段对模板扩增，即用引物a和b扩增一个片段，用引物c和d扩增另一个片段。除去多余的引物后，将两对扩增片段混合，由于两个片段中各有一条链3′端有部分碱基互补，它们变性并复性后必然有部分DNA链发生重组，即3′端形成异源部分双链DNA。重组的异源DNA双链可以互为模板互为引物，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，得到两个扩增片段连接起来的完整DNA双链。再以此片段为模板，用引物a和d进行PCR扩增，即可得到大量的重组DNA片段。 引物a 引物c 引物b 引物d 5 3 PCR 混合，变性和复性 延伸 异源部分双链DNA形成 5 5 5 5’ 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 PCR 引物a 引物d 再次 PCR 5 5 3 3 图6-4 重组PCR原理示意图 （五）锚定PCR（anchored PCR，APCR） 锚定PCR属于单特异引物PCR方法，用于扩增一侧序列已知，而另一侧序列未知的核酸片段。其基本原理是：抽提细胞总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3′端加上poly（dG）。据此设计锚定引物poly（dC），为提高扩增特异性，poly（dC）在十二聚以上，锚定引物5′端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的3′端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行PCR扩增。 （六）不对称PCR（asymmetric PCR） 在基因分析中，常常需要单链DNA，不对称PCR可产生大量单链DNA。其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50~10