Gene engineering 基因工程重点.docVIP

基因工程 第二章 基本技术 1.琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis 原理：DNA带的负电荷数、DNA的分子质量、凝胶浓度、缓冲液成分的不同导致了DNA电泳移动的多态性。 PFGE:脉冲电场凝胶电泳Pulsed field gel electrophoresis CHEF：曲线夹均匀电场电泳Contour-clamped homogeneous electrical-field electrophoresis 凝胶中DNA的检测：溴化乙腚染色（EB）、银染、花青素染色 应用：DNA分析、DNA准备、DNA-蛋白质相互作用凝胶阻滞分析、DNase 1足迹分析 2. 几种印记 Southern blot(DNA 印迹）：酶切的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分离，碱变性后转移到固相支持物（NC膜）上，用标记的探针检出目的片段所在位置的方法。 Northern blottting(RNA印迹)：不同分子量的RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离，转移到固相支持物上，用特异探针检出目的RNA所在位置的方法。 Western Blotting(蛋白质印迹,免疫印迹): 不同分子量的蛋白质经SDS分离，转移到固相支持物上，用特异的抗体检出目的蛋白所在位置的方法。 3.大肠杆菌的转化 方法：用CaCl2处理的大肠杆菌可以吸收外源DNA 影响转化的因素： 大肠杆菌的类型（The transformation efficiency for E.coli(recBC+)is only 10% of that(recBC-)）、 限制系统（外源DNA的识别和降解）、 金属离子（Ca2+, Mn2+能加速转化）、 环境条件（低温、热激） 4.电穿孔Electroporation 原理：高压电击能导致细胞膜形成微孔，用这种方法处理的细胞能从溶液中吸收外源DNA。 影响电穿孔效率的因素：A温度、B电场限制因素（V,R,C）、C外源DNA的拓扑构象、D宿主细胞的因素（遗传背景、生长条件、脉冲处理） 5.常用的几种转化方法：A原生质体转化、B脂质体和宿主细胞脂膜的融合、C电穿孔、D通过植物细菌或病毒转化(农杆菌)、E用CaCl2处理 6. Polymerase Chain Reaction(PCR) 反应体系： 1.Template: DNA 2.Primers(2) 3.dNTP(dATP,dTTP,dCTP,dGTP) 4.Taq DNA polymerase 5. Buffer 过程：A变性94℃, 0.5min、 B 引物退火55 ℃, 1.5min、 C延伸72 ℃, 1min 25-35 cycles 注意：Taq DNA polymerase缺少 3’to5’外切酶活性（校正活性） 影响PCR的主要因素 引物——理想的引物应该：A长度为17~30个核苷酸；B. GC含量约为50%；C 避免串联重复序列； D 无明显的二级结构； E 两个引物之间不互补 热启动方案——DNA聚合酶应该在第一次热处理之后加入，以避免形成错配的引物-模板复合体； 热启动方案的一个替代方案是：一开始就向反应体系中加入Taq DNA polymerase的抗体。 嵌套引物——用第一个循环扩增出的DNA作为模板，以避免引物对模板的非特定位点的错配。 7. RT-PCR：反转录PCR——起始模板为RNA 8. Long accurate PCR(LA-PCR)：长链精确PCR——向反应体系中加入有校正能力的热稳定性聚合酶（高保真） 9. Real-time quantitative PCR：实时定量PCR Real-time——可以随时检测产物e.g. 1,2,3…cycles 反应体系：向体系中加入一个5’端有报告荧光染料标记并且3’端有淬灭燃料标记的探针，在完整的引物中没有荧光发射。如果探针的5’端被Taq DNA聚合酶被降解，荧光染料被释放，一个荧光信号就会被检测到。信号的强度与被扩增的目的DNA数量呈正比。 第三章 DNA分子的切割 1. R-M（restriction and modification切割和修饰）系统的类型——四种内切酶（选择题） type I：切割、修饰是同一个酶，该酶有不同的亚基来执行识别、切割、甲基化，识别和甲基化的序列是相同的单一序列，在1000bp以外进行切割。 type II：切割、修饰是在两个不同的酶上，这两个酶都识别相同的靶序列，而且这两个序列是对称的。 type III：同一个酶，有两个不同亚基，一个用来识别、修饰，另一个用来切割但在24~26bp以外切割。 type IV：两个不同的酶，识别序列不对称，切割发生在识别序列的另