小鼠类风湿关节炎动物模型的建立1.pptVIP

小鼠类风湿关节炎动物模型的建立 学生：张梦云 专业：风湿免疫 类风湿关节炎 类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫性疾病。主要表现为双手、腕和足关节的对称性多关节炎，也可累及膝、髋等大关节。同时可伴有发热、贫血、皮下结节及淋巴结肿大等关节外表现，血清中可出现多种自身抗体。 目的 建立一个稳定的可靠的类风湿关节炎动物模型，为RA的发病机制研究和药物筛选提供必要的手段。 原理 用牛Ⅱ型胶原加佐剂免疫动物。 佐剂型关节炎（AA）模型 Ⅱ型胶原诱导的关节炎（CIA）模型 弗氏佐剂 完全佐剂（CFA） 不完全佐剂（IFA） 佐剂型关节炎模型 佐剂型关节炎（Adjuvant Arthritis, AA）的发病机制主要是分子模拟理论： 结核杆菌的一个蛋白分子与关节滑膜上的一个糖蛋白分子结构相似，可以被同一株克隆T细胞所识别，从而诱发产生关节的免疫反应。 AA模型由细菌学家Freund于20世纪50年代创立，是研究免疫性关节炎动物的基本方法。 Ⅱ型胶原诱导的关节炎（CIA）模型 Ⅱ型胶原（CⅡ）大多存在于关节软骨中，同时也存在于视网膜和玻璃体中，是一种与免疫系统隔绝的蛋白质，但在病理条件下可作为一种自身抗体呈现出来。 50%RA患者血清中存在抗CⅡ的自身抗体，这表明CⅡ可诱导产生关节炎性质的自身免疫反应。 1977年，Trentham等首次建立CIA模型，国外大量重复试验并在临床表现，病理组织学，免疫学方面进行了广泛深入的研究。 完全佐剂（complete Freund adjuvant, CFA） 液体石蜡与无水羊毛脂按2:1或者6:4比例混合的混合液1ml，高压灭菌加入80℃灭活1h的减毒卡介苗或干燥结核死菌10mg制成。 不加入卡介苗则为不完全佐剂（incomplete Freund adjuvant, IFA）。 对象与材料 动物：8周龄雄性小鼠，体重18-20g。 试剂：1)牛Ⅱ型胶原。 2)完全佐剂和不完全佐剂。 3)注射用水。 方 法 胶原诱导小鼠关节炎模型建立 1）将牛Ⅱ型胶原溶于0.1M冰乙酸溶液中，浓度2mg/ml，4℃过夜。 2）弗氏完全佐剂补加已灭活的结核杆菌，使其浓度达5mg/ml。 3）将牛Ⅱ型胶原乙酸溶液与完全佐剂等量混合并乳化。 4）每只实验小鼠背部取4-6点进行皮下注射，总共200?l。 5）三周后用不完全佐剂，与牛Ⅱ型胶原乙酸溶液等量混合并乳化，每只小鼠尾根部取3-5点皮下注射，总共100?l。 设置对照组 佐剂组：只给小鼠注射佐剂，不加胶原。 注射用水组：给小鼠注射用水，不加胶原和佐剂。 观察记录 一般在第二次免疫后7-12天实验组小鼠80%以上出现关节炎症状。根据小鼠关节部位红肿及活动程度进行临床症状分级。在实验前和实验后的第3,5,7,12天分别观察记录。 测 定 实验前后小鼠后肢关节体积测定： 采用小鼠爪足体积测量计 测量每只小鼠后腿膝关节约5mm以下体积，反复三次，记录取平均值，体积大小与关节红肿程度成正比。每三天检测一次。 病理检查 取实验组和对照组小鼠肢体，去外皮，4%甲醛固定48小时以上，5%硝酸脱钙2小时，二甲苯浸润，石蜡包埋。制成6mm切片，HE染色。 常规光学显微镜观察，制定评分标准，进行病理学诊断。 记录 用双盲法在给药前和给药后第3、5、7、12天记录各组小鼠的活动及关节红肿情况，并打分。 后肢体积测量 各组小鼠实验前测量后肢体积，二次免疫后，每隔三天再次测量后肢体积，比较注射前及注射后第12天的后肢体积。测量结果显示体积大小与关节红肿程度成正比。 病理改变 病理观察结果显示，小鼠肢体关节主要有滑膜增生，炎细胞浸润，血管变性，软骨层破坏等病理改变。出现上诉1-2种病理改变者为轻度病理改变，3种以上者为中度，4种以上者为重度。 讨论 RA动物模型只是在一定条件下侧重于某些因素而建立起来的，故其并不能完全反应RA的所有特点。 其次，RA患者所表现的关节肿痛晨僵发热等不适都可以通过患者的主诉反映出来，但在RA动物模型中这些指标却不能被体现出来。 理想的RA动物模型的条件 1、在病原学和发病机制方面与人类相似； 2、临床表现与组织病理改变与人类相似； 3、模型容易获得，施加相同实验条件获得的结果相同； 4、模型建立后，效果稳定并可以长期维持。 寻找一种与人类种属接近，容易建立并能较全面的反映RA特点的动物模型将是今后RA动物模型的研究方向。 * * 佐剂组 注射用水组 实验分组 实验组 90