五 DNA制备、鉴定及含量测定.pptVIP

DNA的提取、鉴定及含量测定 1.初步掌握从生物组织中分离DNA的方法， 进一步了解DNA的物理化学性质。 2.掌握DNA纯度鉴定的原理和方法。 以NaCl 溶液为例：在稀NaCl（0.14mol/L）溶液中，RNP中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度很小。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，因此通常可用1.4mol/L NaCl提取DNA。将RNP与DNP分开。 分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白质等杂质除去，常用的去除蛋白质的方法有3种： ①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变形蛋白，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用SDS等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。 ③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，变性蛋白则停留在分层内。吸出上面水相，将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用 RNase 处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在PH值4.0-11.0间较稳定，在此范围外就会使核酸变性降解，应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜破坏时被释放出来，它会降解DNA分子，故须用酶的抑制剂、变性剂使之失活。操作过程最好在低温下进行。常用酶的抑制剂有柠檬酸盐、EDTA-Na等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 1.实验材料： 新鲜兔肝或新鲜菜花 3.实验试剂(CTAB 法)： 5 mol/L NaCl溶液;0.14 mol/L NaCl- 0.15 mol/LEDTA-Na溶液；20%SDS溶液； 95％乙醇溶液；丙酮；石英砂。 DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.01mol/LNaOH溶液溶解，转移至50ml容量瓶中，用0.01mol／LNaOH溶液稀释至刻度。浓度为200μg/mL； DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品，溶于0.01mol/LNaOH溶液中，配成200μg/mL左右的溶液。二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100mL分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10mL混匀。临用前加入1mL1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。 氯仿：异戊醇=24：1 【主要试剂的作用】 EDTA的作用： 1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2.降低细胞膜的稳定性 SDS的作用： 1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂； 2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来； 3.对RNA、DNA酶有抑制作用； 4.与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性。 95%乙醇作用： 沉淀加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。 乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 氯仿：可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 异戊醇：氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 1.核蛋白的制备： 称取6g 新鲜菜花经冷冻后，加入6mL 0.14mol/L NaCl-0.15 mol/LEDTA-Na溶液（即稀盐溶液）和少许石英砂研磨成匀浆，转入离心管中，用24mL稀盐溶液分洗研钵3次，一并转入离心管中，以3000r/min的 转速离心10min后，弃上清液，用稀盐溶液小心冲洗沉淀1-2次，除净白色的脂肪。(得到DNP沉淀) 2.DNA与蛋白分离： 在含有DNA核蛋白沉淀的离心管中加入10mL稀盐溶液，用玻璃棒小心搅拌使沉淀悬浮，然后滴加20%SDS溶液2mL，边加边轻轻搅拌。然后置60℃水浴中保温10min，并不停地轻轻搅拌，取出冷却至室温。 3.DNA粗制品的提取： 向上述溶液中加入5 mol/LNaCl溶液4ml，使 NaCl溶液最终浓度约为1mol/L，然后慢速轻轻搅拌10min，以4000r/min的转速离心10