慢性毒性实验.docVIP

慢性毒性试验 1、材料与方法 1.1 试剂 1.1.1 MCLR样品 实验所用MCLR由室内培养的铜绿微囊藻提取分离，通过HPLC纯化获得（HPLC检测纯度≥98%）.取一定量MCLR的甲醇溶液，减压浓缩蒸干，定容于蒸馏水中，配制成2.75μg/mL的MCLR水溶液。 1.1.2 鱼肉样品 取市售新鲜鳙鱼（经HPLC法和ELISA法检测不含MCLR），参照文献[16]报道的方法制备鱼肉粉末:低温下取鱼肉，匀浆后冷冻干燥，然后研磨成粉，过30目筛，所得样品避光冷藏保存，以保持其活性.实验前，按照1:5（质量比）的比例向鱼肉粉末中加入制备好的MCLR水溶液，搅拌0.5h后，常温静置4h。 1.2 主要仪器 Waters600Ｅ型高效液相色谱仪，配有双波长紫外可见检测器，分析柱18（5μ，46mm×250mm），Ｃ18半制备柱（10μ，19×300mm）;冷冻干燥机（1.2LD）;生物显微镜（1）;全自动生化分析仪（2700）。 1.3 实验动物及染毒方式 湖北省防疫站提供的级雄性小鼠54只，体重（20±2），随机分成3组（2个处理组和1个对照组），每组18只.经口灌胃染毒，处理组按照6875μg/kg（以单位体重计，下同）剂量，分别给予水溶态MCLR、鱼肉结合态MCLR，对照组给予等体积的蒸馏水1周内连续染毒5，每天1次，染毒13周。 1.4 观察指标与方法 1.4.1 一般中毒症状和体征 染毒期间观察小鼠体重增长情况、饮食、活动状况及一般中毒表现。 1.4.2 脏器系数 于实验第1、3、5、7、9、13周，每组随机取3只小鼠，空腹称体重，摘除眼球取全血，准确称量小鼠肝脏、肾脏的重量，按照脏器系数=脏器重（）体重（）计算各脏器系数。 1.4.3 组织病理学 观察取新鲜小鼠肝脏、肾脏组织，分别固定于10%福尔马林溶液中，24ｈ后石蜡包埋、切片、常规ＨＥ染色，在光镜下观察各组织结构变化. 1.4.4 血清酶学指标的测定 小鼠血液标本常温静置2后，离心取上清液，用全自动生化分析仪进行检测.检测指标有:天冬氨酸氨基转氨酶（）、丙氨酸氨基转氨酶（）、碱性磷酸酶（）、肌酐（）、尿素氮（）。 1.5 统计处理 用13.0软件包对所有实验数据进行ｔ检验。 2、结果与分析 2.1 临床观察结果 实验期间，各组小鼠饮食无明显差异，死亡率均为零.实验前6周，各组小鼠体重增长基本一致;从第6周到实验结束，对照组小鼠体重增长最快（2192g增加到2602g），水溶态MCLR染毒小鼠次之（2192g增加到2540g），鱼肉结合态MCLR染毒小鼠最慢（2145g增加到2477g）.但是各组间均无统计学差异（0.05）。 2.2 脏器系数 表1是不同形态MCLR对小鼠部分脏器系数的影响由表1可见，经水溶态MCLR染毒的小鼠，在整个实验过程中肝脏系数均大于对照组，其中除了第9周以外，其他时间均与对照组有显著差异（0 05）由于脏器系数的变化是脏器受到损伤的综合反映[17]，肝脏作为的主要靶器官，其脏器系数也会由于受的影响而增加[18]小鼠肝脏系数的增加，说明水溶态MCLR可能对小鼠的肝脏造成了损伤.与水溶态MCLR相比，鱼肉结合态MCLR对小鼠的肝脏系数影响不明显，染毒过程中肝脏系数仅在第1周显著高于对照组（0.05）可见，灌胃染毒时，水溶态MCLR的毒性明显要大于鱼肉混合态MCLR。 有研究表明，MCLR对肾脏也具有一定的毒性[19，20]。然而表1结果显示，经水溶态MCLR和鱼肉结合态MCLR染毒的小鼠，肾脏系数与对照组相比并没有显著的差异（0 05）。说明该染毒方式下2种形态MCLR对小鼠肾脏的影响并不明显。 2.3 酶学指标检测结果 表2为不同形态MCLR对小鼠血清酶学指标的影响。 由表2可见，在整个实验期间，经水溶态MCLR染毒的小鼠活性显著高于对照组（0.01），并且活性随着染毒次数的增加有明显的先升高后降低的趋势，这一变化规律类似于慢性肝炎的症状[21]。的活性也有相同的变化规律，只是活性的增加没有显著。而活性在整个实验过程中与对照组没有明显的区别，基本维持在正常水平。 与水溶态MCLR相比，鱼肉结合态MCLR对小鼠的3种肝脏酶学指标的影响均很小，的活性仅在染毒的第1周有显著增加（0 05），而和活性在整个实验过程中与对照组相比没有明显差异。 和是肝脏的2种特异性酶，其活性的增加通常是肝细胞受到损伤的表征，的急性和慢性毒性实验均发现这2种酶活性的增加[22，23]。本研究结果显示，经灌胃染毒，水溶态MCLR可以使和活性显著增加，而鱼肉结合态MCLR对和的影响则不明显，说明鱼肉结合态MCLR对小鼠肝脏的影响明显小于水溶态MCLR。 由实验各组小鼠肾脏酶学指标（和）的检测结果可以看出，与对照组相比，水溶态MCLR染毒小鼠的略高，而鱼肉混合态MCLR染毒小