基因工程-载体构建蛋白表达.ppt

原核细胞与真核细胞的区别 原核表达与真核表达的区别 原核基因表达以操纵子形式进行 转录和翻译几乎同时进行 真核转录在核内进行，先形成hnRNA,再加工剔除内含子，外显子相连，5’端加帽， 3’端加poly A尾巴。 翻译在胞浆的核糖体上进行 乳糖操纵子学说(原核基因的表达调控) 第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达 原核基因表达载体的构成 常见的原核细胞表达载体系统 外源目的基因在原核细胞中的表达形式 在原核细胞中高效表达目的基因 一、原核基因表达载体的构成 DNA复制及重组载体的选择系统 复制子: 扩增 选择标记：筛选 外源基因的转录系统 启动子 抑制物基因 转录终止子 蛋白质的翻译系统 核糖体结合位点 翻译起始密码子 翻译终止密码子 pBR322old-style general purpose plasmid DNA复制及重组载体的选择系统 复制子：包含复制起始位点（ori)和有关序列在内的DNA片段。 常见复制子有pMB1, p15A,Col E1和pSC101等。 前3者为松弛复制型，含pSC101复制子的质粒载体严谨复制型。 选择标记：抗生素抗性基因 外源基因的转录系统 启动子:能被宿主RNA聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位置特性和种属特异性。 诱导型启动子：Lac、Trp、Tac等 组成型启动子：T7噬菌体启动子 抑制物基因:其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。 转录终止子：终止RNA聚合酶转录的DNA序列。 本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子， 依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如ρ因子） 防止转录过头 3）蛋白质的翻译系统 影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、 mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列 核糖体结合位点 翻译起始密码子 翻译终止密码子 核糖体结合位点：原核生物转录起始位点(RBS)下游的一段DNA序列，由SD序列和起始密码子组成。 SD序列大约3-9bp,位于ATG上游3-11bp处。SD序列可与核糖体16S rRNA特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌SD序列为 5’AGGAGG3’，其中GGAG 4碱基发生任何改变均大幅度降低翻译效率。 翻译起始密码子：一般为ATG(AUG),编码甲硫氨酸(Met),也有采用其他密码子。 影响翻译效率的因素有：SD序列、翻译起始密码子、 SD序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道， SD序列后面为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高，而当为CCCC或GGGG时效率最低。 翻译终止密码子：它核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子RF1和RF2调控。 RF1识别UAA和UAG, RF2识别UAA和UGA，故选UAA作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉UAAU为有效终止密码子。 二、常见的原核细胞表达载体系统 Plac启动子表达系统 PL 和PR启动子表达载体系统 T7噬菌体启动子表达载体系统 三、外源基因在原核细胞中的表达形式 包涵体 融合蛋白 寡聚型外源蛋白 分泌型外源蛋白 （一）包涵体 外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。或许也有一些受体细胞本身的蛋白质。 包涵体具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，故没有生物学活性。 需要复性 （二）融合蛋白 定义：将外源目的蛋白的基因与受体菌自身蛋白基因重组，但不改变两个基因的阅读框而表达出的蛋白。 融合蛋白的特点 1. 稳定性好 单独的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被原核细胞中的蛋白水解酶所降解。 融合蛋白中，外源蛋白在菌体自身蛋白的引导下，能正确折叠，形成杂合构象，封闭了暴露在分子表面的蛋白酶切割位点。 融合蛋白的特点 2. 表达效率较高 转录和翻译由宿主菌的固有设施控制。 3. 易于分离纯化 利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源目的蛋白。 （三）寡聚型的外源蛋白…多个外源蛋白基因串联 多表达单元的重组 多顺反子重组 多