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 基因工程和细胞工程 福建师范大学生命科学学院 基因工程的基本操作程序 基因文库(gene library)概念 又称DNA文库,是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后,转化宿主细胞,通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。 基因组文库(Genomic library) 将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息,可用于分离目的基因和保存某种生物的全部基因。 cDNA文库 (cDNA library) 提取某生物组织或发育时期的总mRNA,经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 cDNA(complementary DNA,互补DNA):是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片段,或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA; 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA; 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌; 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为: 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库(细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库)。 基因组文库的质量标准 一个理想的基因组文库应具备下列条件: 重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力; 载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆; 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序; 克隆片段易于从载体分子上完整卸下; 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 cDNA文库的主要优点 ①cDNA文库特别适用于某些RNA病毒的基因组结构研究及有关基因的克隆分离; ②cDNA文库较小,易于筛选; ③cDNA文库可用于在细菌中表达真核生物的基因; ④cDNA文库结合基因组文库可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响; cDNA文库不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息; 在cDNA文库中,高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低,因此分离也就比较困难。 从基因文库中筛选目的基因 1.通过克隆序列筛选:核酸杂交(探针)和PCR(引物) 2.通过表达产物筛选:免疫学检测(抗原抗体反应) 探针 探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp), 用于检测与其互补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针,通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法,将探针核苷酸的侧链加以改造,探针杂交后,其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别,从而显示出位置。 菌落原位杂交法(核酸杂交) 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。 PCR筛选法 利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因序列所在克隆。 高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此,要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常困难,因此先把材料DNA分成若干易于处理的片段,然后确定目标序列在哪一片段,再进一步从该片段寻找目标序列,事情就变得容易了。 PCR法获取目的基因 已知基因: 设计合成一对引物,直接从基因组DNA(或文库)中扩增该目的基因。 未知基因: 参照其他物种中该基因的两末端设计引物,从基因组DNA(或文库)中扩增该目的基因; 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物,扩增出一段DNA,标记为探针,从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是:要有足够制备合适引物的信息 PCR法获取目的基因优点 1.简便快速:在有足够引物信息的情况下,可直接从基因组DNA中克隆目的基因,大大减少了基因分离的工作量; 2.灵敏度高:可从极微量的模板扩增出目的片段; 3.对起始材料质量要求低:由于其灵敏度高和特异性强,极微量的材料或者混合的组织、部分