[医学保健]自生固氮菌的分离纯化.pptVIP

自生固氮菌的分离纯化 一、目的要求: 1、学习微生物纯系分离、培养方法。 2、掌握划线分离纯化微生物的方法。 二、基本原理: 为了生产和科学研究的需要,往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种,这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。 为了获得某种微生物的纯培养,可采用下列两种方法:一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌,则其培养基中是不能含有N源,这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质,以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌,往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红,链霉素和金霉素等化学药品,目的在于抑制细菌生长,这样更有利于获得其纯培养。 土壤中微生物数量众多,在肥沃土壤中固氮菌数量也很多,自然界中多数氮素养料是由微生物固氮的结果,固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。 要分离自生固氮菌,常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基,控制其适宜环境条件,使它在培养基上大量繁殖,然后通过稀释法和划线分离纯化法,使它在培养基上形成单菌落,如分离所得不纯,需要进一步纯化,直到得到纯种. 三、材料与仪器 1、培养基:阿斯毕无氮培养基。 2、菜园土。 3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等 四、方法与步骤 (一)富集培养: 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基倒成平板。 2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养基上。 3、正面放置培养箱中培养,28oC培养3~4天后,在土粒周围有混浊半透明的胶状菌落出现,有的在后期会产生褐色的色素。 (二)划线分离纯化:(下次实验) 1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。 2、用接种环挑取上述菌落少许,在冷凝平板上进行划线分离,而后置28oC培养4天。 划线方法如图: (三)纯化、镜检,得到纯种培养 1、平板上出现单菌落,按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中,28oC培养4天。 2、镜检:将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大,常呈单个或“8”字排列,在细胞表面有较厚的荚膜者,即为自生固氮菌。如有杂菌,需要进一步划线纯化。 3、将得到纯化菌株,移接到另一阿斯毕培养基斜面管,28oC培养3~4天,即获得纯培养菌,可冷冻保存,备用。 五、注意事项: (1)在微生物分离、纯化每一操作环节,要严格按照无菌操作进行。 (2)平板划线时,划线部位不可重叠。 (3)划线时,每次都要将接种环上多余菌体烧掉。 (4)培养皿要贴标签,包括班级、姓名 六、思考题 1、分析阿斯毕培养基成分,说明其适用于分离自生固氮菌的原因。 2、划线分离时,为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉?划线为何不能重叠? 3、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养?应注意哪些问题。 稀释平板计数法 微生物的平板计数是根据在固体培养基上所形成的菌落,即是由一个单细胞繁殖而成,且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的.也就是说一个菌落即代表一个单细胞. 计数时,首先将待测样品制成均匀的, 一系列不同浓度的稀释液,并尽量使样品中的微生物细胞充分分散开来,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不是代表一个菌),再取一定稀释度,一定量的稀释液接种到培养皿中,并使其均匀分布于培养皿中的固体培养基中,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌个数. 十倍稀释法示意图: 依次各1ml 1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 样品 99ml 每管各9ml无菌水 无菌水 每皿15ml 琼脂培养基 十倍稀释法示意图: 依次各1ml 1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 样品 99ml 每管各9ml无菌水 无菌水 每皿15ml 琼脂培养基 操作步骤: 1、稀释样品(十倍稀释法) 2、稀释液的分离: 3、观察计数结果:(下次实验做) 总活菌数/1克样品=同一稀释度菌落平均数 X 稀释