分子标记法.ppt

RAPD技术流程： 目的基因的定位与分离： 利用与目标质量性状紧密连锁的分子标记进行质量性状选择是一种有效途径。标记目标性状基因日前主要是利用分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis.简称RsA)和近等基因系法(Near Isogenis Lines.简称NILS)。近年来各主要农作物上均有许多重要的质量性状基因被标记，如水稻上的抗稻瘟病基因、光敏不育基因、矮秆基因、小麦上的抗白粉病基因、抗叶锈基因、春化反应基因及耐盐基因等。 位于基因组内的SNP可以分为2种形式: 一是基因编码区的突变 ,主要分布于基因编码区内(coding region) ,故又称其为cSNP; 二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异 ,又分为基因周边SNP (peripheral SNP, pSNP)及基因间SNP ( intronic SNP, iSNP) .研究表明基因周边SNP频率比基因编码区SNP频率高。 SNP标记技术，主要包括两个方面：SNP位点的发现和SNP分型。 发现SNPs方法:包括直接对PCR产物进行测序、用鸟枪法从基因组文库以及EST文库筛选序列等技术来筛选或检测SNPs。 通常从待测定的基因或ESTs提供的序列设计引物，扩增出目的片段，对扩增产物进行双链测序。然后，还要对所得序列进行排序并仔细鉴别真正的多态性和由于测序误差而产生的差异。也可以通过生物信息学相关软件查找预测SNP。 SNP的检测方法分成四大类: （一）基因芯片技术 　　基因芯片技术：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。 （二）Taqman技术 　　在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，他们分别与两个等位基因完全配对。探针运用了荧光共振能量转换技术，探针的5’端和3’端分别用特殊染料标记，称为供体-受体染料对或爆-猝灭燃料对。 （三）分子信标技术 　与Taqman技术相似，分子信标技术也是在PCR反应体系种加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过仪器检测荧光值的变化，进行基因分型。 （四）焦磷酸测序法 　　焦磷酸测序法是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。 SNP的应用 1、人类基因单体型图的绘制 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导与药物设计 通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，另外，随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的基因型来设计药物将成为可能。 SNP优缺点： 优点：（1）SNP具有共显性，能获得的标记数量多，易于实现高通量。 （2）SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 缺点:芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。 3、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记 ①　扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。　 AFLP标记： 基本原理：基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一些带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。结果只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。 AFLP操作流程： 1 植物基因组DNA的提取 2 DNA被限制性内切酶切割 3 与AFLP聚核苷酸接头(adapter)连接； 4 利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg； 5 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段； 6 银染。 EcoR I Mse I （限制性内切酶） EcoR I接头 Mse I接头 EcoR I引物+A Mse I引物+C （预扩增） EcoR I引物+AAC Mse I引物+CAA （选择扩增） （连接） （电泳检测） 利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。所以说AFLP技术是一种新的且功能强大的DNA指纹技术。 AFLP的特点： AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD两种技术的优点，具有