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仪器指南 PCR常见问题及回答 一 、 RT—PCR 减少引物的用量 优化PCR反应条件 ／减少PCR的循环次数 1．cDNA产量的很低 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其 可能的原因： 产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显 *RNA模板质量低 示为弥散背景。 对mRNA浓度估计过高 5．产生大分子量的弥散条带 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非 不足 特异性的起始及延伸产生的 同位素磷32过期 对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的 反应体积过大，不应超过5O l 浓度稀释至h10(或 1：100—1：200) 2．扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 6．在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结 最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应 果 体系而不是RT—PCR的反应体系 通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致 与反应起始时RNA的总量及纯度有关 的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消 建议在试验中加入对照RNA 除。建议可将第一链cDNA稀释1：10、1：100、1：1000倍 第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的 以消除DNA污染所造成的影响。 反应体系中的含量不要超过 1／10 有可能是引物二聚体的条带 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引 7．扩增产物滞留在加样孔中 物 (GSP)用于第一链合成。由于RNA模板存在二级 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生 结构 ，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火； 了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀 或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。 释100倍再进行二次扩增。 目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引 用以下方法解决： 物的Tm值低5~C，可以将退火温度适当增高或进行热 a．将第一链的反应温度提高至50~C。