TUNEL说明书.doc

TUNEL说明书 1 介绍 TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。 多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。 凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。TUNEL可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome? 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞 这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。 检测原理: DeadEnd? Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。 2 产品内容 G7361 平衡缓冲液（G327B）——4.8ml 末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul 抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul 生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul 蛋白酶K（V302A）——10mg G7362 塑料盖玻片（G326B）——20 20X SSC（G329B）——20ml DAB 20X 色原体（G716A）——200ul 20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul 20X过氧化氢（G718A）——200ul 储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。将链亲和素HRP, DAB 20X Chromogen, 20X DAB底物缓冲液和20X过氧化氢储存于 4°C。20X SSC和塑料盖玻片室温保存。 ★★注意不同的成分保存条件不同！ 在用蛋白酶K之前，将蛋白酶K重组到1ml的蛋白酶K缓冲液中（见第五部分），保存10mg/ml的蛋白酶K溶液于-20度，酶的稳定性渴持续至少六个月。 安全说明：平衡缓冲液含有二甲胂酸钾，避免眼睛和皮肤接触，请戴上手套和防护眼镜。DAB是可疑的致癌物，请戴上手套和防护眼镜。 3 试剂盒程序 3.1 概述 （1）使用者需提供试剂： PBS 磷酸盐缓冲盐水 0.3%过氧化氢溶液抑制内源性过氧化氢酶 固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛） 封固剂 ★★ 注意不要用20X过氧化氢制备0.3%过氧化氢溶液，用来抑制内源性过氧化氢酶。 （2）石蜡包埋切片的辅助试剂 ﹡二甲苯或二甲苯替代物 ﹡去离子水稀释的乙醇（100%，95%，85%，70%，50%） ﹡0.85%氯化钠溶液 ﹡蛋白酶K 缓冲液 ﹡DNase I(胰脱氧核糖核酸酶I) ﹡胰脱氧核糖核酸酶缓冲液 （3）组织切片的辅助设备 ﹡多聚赖氨酸覆盖或硅烷化的显微切片 ﹡coplin jars（coplin器，选择性DNase I阳性对照切片需要单独的的coplin器） ﹡镊子 ﹡湿盒 ﹡37度保温箱 ﹡微量移液器 ﹡盖玻片 ﹡干净的指甲膏或胶布 ﹡显微镜 3.2步骤 （1） 将石蜡组织切片置于染色缸中，室温下新鲜二甲苯浸洗2次，每次5min； （2）染色缸中，室温下100%的乙醇浸洗5min； （3）100%的乙醇重复浸洗3min，室温下依次用95%、85%、70%和50%的乙醇各浸洗一次，每次3min； （4）室温下置于0.85%氯化钠溶液浸洗5min； （5）室温下置于PBS中浸洗5min； （6）室温下置于4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15 min； （7）PBS浸洗二次，每次5 min； （8）将载玻片取出置于一水平表面，用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加100μL新配制的蛋白酶K工作溶液（在PBS中以1：500稀释10mg/ml蛋白酶K原溶液，得到20ug/ml蛋白酶K溶液）覆盖在样本区域上，室温下放置10～30min； ★注意：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（come off the slid