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培训目的 目录 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 生长规律在发酵培养应用 菌种筛选意义 自然分离筛选原理 自然分离筛选原理 纯种培养的意义 纯种培养基本要点 操作无菌注意事项 本章小结 相关概念 相关概念 相关概念 相关概念 纯种培养设施 只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。 在微生物纯种培养过程中出现的与培养菌种不同的其他菌种,称为杂菌。 在发酵培养过程中由于控制不当使培养体系内引入杂菌的现象。 纯种 培养 染菌 杂菌 * * LOGO * * LOGO * LOGO 培菌员岗位培训 聚合物二厂采用特种细菌细胞作为单体生产水合反应的催化剂。制菌室通过无菌操作、微生物培养、指标检测等操作完成丙烯腈水合酶生产菌的选育工作，以保证生产菌的催化能力并为其在单体发酵工段大量生产提供优质菌种来源。 通过本次培训，使培菌员掌握菌种生长规律、选育流程、无菌操作要点。 丙烯腈水合酶生产菌生长规律 丙烯腈水合酶生产菌选育流程 生产菌纯种培养要点 本章小结及思考题 菌体 形态 菌体 数量 生长 速率 代谢 情况 丙烯腈水合酶生产菌在发酵培养过程中 随着培养时间的延长 延迟期 对数期 稳定期 衰亡期 细胞个数 生长速率 延迟期 培养时间（hr） 0 （+） （-） 在发酵培养初期，菌种对新的培养环境有一段适应期，为细胞分裂繁殖进行准备。延迟期内菌种生长速率为0，菌种数量不增加，对不良环境敏感，菌体形态增大、变长。 延迟期生长代谢规律 细胞个数 生长速率 培养时间（hr） 延迟期 0 （+） （-） 对数期 菌种对培养环境适应后开始进入分裂繁殖阶段，菌种生长速率增大，并达到最大值，菌种数量成几何级数增长。抗不良环境的能力强，形态均匀，有明显的分裂横隔。在对数后期，菌体细胞开始合成丙烯腈水合酶。 对数期生长代谢规律 细胞个数 生长速率 培养时间（hr） 延迟期 0 （+） （-） 对数期 稳定期 随着培养基内营养物质消耗、有害代谢产物的累积，菌种开始出现衰亡。新繁殖的细胞数与衰亡细胞数逐渐相等，生长速度趋向于零，活菌数达到定值。菌种形态为均匀的颗粒型。稳定期内，菌体细胞大量合成水合酶，酶活迅速上升。 稳定期生长代谢规律 细胞个数 生长速率 培养时间（hr） 延迟期 0 （+） （-） 对数期 稳定期 衰亡期 随着外界环境对继续生长的菌体越来越不利，死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。细胞开始出现膨大、自溶破碎。细胞内水合酶释放到细胞外，检测发酵液酶活性迅速下降。 衰亡期生长代谢规律 生物量 酶活性 发酵培养周期 在丙烯腈水合酶的发酵培养周期内，对数期生物量迅速增加，在后续生长阶段趋于稳定；水合酶在稳定期内大量积累，检测酶活性迅速上升并达到最大值。 发酵培养应避免衰亡期的出现，作为以丙烯晴水合酶为最终产物的发酵培养过程，在稳定期检测培养基内合成水合酶的营养物质消耗殆尽，菌体酶活趋于稳定时为最佳发酵培养终止点。 降低生产能耗 减少单体杂质 减少发酵液用量 缩短培养周期 提高反应专一性 优质菌种 提高催化能力 母代 正变 负变 子代 菌种在传代培养过程中，子代保留母代的基本特性（遗传）的同时，其部分性状会发生变化（变异）。 发生变异的其子代性状优于母代的为正变，反之为负变。 变异后性状劣于母代 保留母代基本遗传性状 变异后性状优于母代 对正变菌种再次传代培养，通过对二代的检测将遗传稳定性好的菌种挑选出来 对筛选对象进行自然传代培养，并通过检测手段将子代中出现的正变菌种挑选出来 初筛 复筛 优质 菌种 选取标准 各项指标达标 无其它杂菌污染 生产线使用效果好 出发菌种 性状检测 传代培养 传代培养 对象分离 单菌株 一代菌种 二代菌种 可判定为单菌落 形态饱满光滑 菌落大小适宜 选取标准 检测标准 PH值7.5±0.5 生物量≥6.0% 菌种形态饱满 酶活性≥1100万 性状检测 保藏备用 稀释倍数106～108 试管斜面 固体培养 28±1℃ 120hr 试管斜面固体培养 28±1℃ 120hr 确保菌种优良性状 确保菌种遗传稳定 自然分离筛选流程 增加单体溶液大分子蛋白杂质含量 对产催化剂的影响 对单体质量的影响 增加单体精制压力、影响单体质量 产生原因 危害 杂菌消耗营养成分、释放有害代谢产物 影响生产菌的生长及产酶 在发酵生产中必须尽量避免杂菌污染；在菌种培养阶段就必须做到纯种培养，杜绝杂菌污染。 染菌 在菌种纯种培养过程中所用的玻璃器皿、接种工具、用品必须包扎好后，经高压蒸汽灭菌后方可使用（灭菌条件0.11MP、30min）。 培养基必须经高压蒸汽灭菌，并检测无杂菌后方可使用（灭