GST标签的去除.docVIP

GST标签的去除 GST标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。根据目的蛋白的性质不同，完全消化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。 含有PreScission蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点的标签蛋白可在与Glutathione Sepharose层析填料结合时切割，或者洗脱后在溶液中切割。当GST蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋白，它与结合缓冲液一起洗脱，而GST部分仍与填料结合。一般来说，柱上切割是推荐使用的方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。如果需要优化切割条件，建议洗脱后切割。 从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa因子和PreScission蛋白酶，可利用Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow来进行，此填料有大包装。为了方便，Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow也有预填充的HiTrap Benzamidine FF 1 ml和 5 ml柱。 凝血酶凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血酶识别序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2及pGEX-4T-3）。在22°C，1×PBS中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。 Xa因子纯化自牛血浆的Xa因子特异切割四肽Ile-Glu-Gly-Arg之后的蛋白，可用于消化包含此序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3）。在22°C，1 mM CaCl2、100 mM NaCl和50 mM Tris-HCl（pH 8.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。 PreScission蛋白酶PreScission蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST组成。这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固定和pGEX-6P载体（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3）所产生的GST融合蛋白的切割。PreScission蛋白酶特异切割Glu和Gly残基之间的识别序列LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。蛋白酶在4°C具有最大活性，因此切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。在5°C，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。 GST标签蛋白可通过亲和层析，利用固定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。GST与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。洗脱在温和、非变性的条件下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。 通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品。Glutathione Sepharose填料（表1）也有多种形式，从预填充的MultiTrap? 96孔过滤板到预装柱的SpinTrap?、GraviTrap?、HiTrap?及HiPrep?柱，或实验室包装（填料包装的体积从25 ml到500 ml）。不同的形式提供了从微克到克规模的样品的纯化选择。 表1. Glutathione Sepharose填料的特征 1 每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。GST蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象和浓度。GST与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通常会提高结合能力。这对于上样过程很重要。蛋白性质、pH和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。 2 室温下的水。 仪器的选择将取决于特定的纯化。在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的GSTrap柱进行分步梯度洗脱。GST MultiTrap 96孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达～500 μg GST标签蛋白。每根GST SpinTrap柱能纯化多达500 μg蛋白。对于更大量的纯化，预装柱如GST GraviTrap、GSTrap和GSTPrep 16/10则提供了卓越的形式。 GST SpinTrap柱GST SpinTrap 柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。柱的设计可用于微型离心机。每根柱子含有50 μl Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多500 μg重组GST。柱子在含有0.05% Kathon?（一种抗菌的防腐剂）的1×PBS缓冲液中经过了预平衡。