RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能研究.docVIP

精品论文 参考文献 RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能研究 陶巍１　张蓓 通讯作者１．徐州医学院;２．徐州医学院临床学院　江苏　徐州　２２１０００ 　　【摘要】　目的　探讨RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能.方法　siRNA 干扰SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞后,比较处理组与对照组间RRM２表达水平,并比较两组细胞侵袭能力.结果:处理组与对照组处理前RRM２表达水平接近,都比较高,处理组在经处理２４h、４８h后RRM２表达水平明显降低,７２h后其水平基本上不变;在经siRNA 干扰后,SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞的侵袭能力明显降低.结论:RRM２在卵巢癌细胞中的表达较高并且与其侵袭力呈正相关. 【关键词】　核糖核苷酸还原酶亚单位M２(RRM２);卵巢癌细胞;侵袭【中图分类号】R７１１ 【文献标识码】B 　　【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－００７９－０１　　 　　RRM２是DNA 合成和修复中的限速酶,是细胞凋亡及其重要的调控基因,在妊娠滋养细胞疾病,乳腺癌,小细胞肺癌.宫颈癌,胰腺癌,子宫内膜癌等多种肿瘤中呈过表达,有研究表明,RRM２的高表达恶性肿瘤的生长以及浸润转移能力呈现正相关[１－２].本文就RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能进行研究. 　　１　主要材料与方法 　　１．１　主要材料trizol(takara)Sybrgreen(toyobo)Transwell小室(８um,millipore)Matrigel(BD)DMEM(Hyclone)FBS(Hyclone) 双抗(Hyclone)FugeneXtremetransfectionreagent(roche)Primer:beta;－actin:F－AAAGACCTGTACGCCAACACR－GTCATACTCCTGCTTGCTGAT(扩增片段长度２１８bp．)RRM２:F－ACCTATGGTGAACGTGTTGTAGR－GGCATCAGTCCTCGTTTCTT(扩增片段长度１０１bp)RRM２siRNA:sense:UGCUGUUCGGAUAGAACAGd(TT)antisense:CUGUUCUAUCCGAACAGCAd(TT)NC:sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUd(TT)antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAd(TT) １．２　方法　(１)细胞处理１．１　SKOV－３和SKOV－３/cDDP 细胞培养在DMEM 高糖培养基中,含１０％ FBS,１％双抗１．２　siRNA 干粉１OD 用１２５ul的DEPC 水溶解后,此时siRNA 浓度为２０uM,分装放至－２０冰箱中冻存备用.１．３　转染前一天,将SKOV－３细胞消化下来,均匀种至六孔板中,每个孔种２times;１０５个细胞１．４　第二天,取９２ulDEPCH２O＋５ulsiRNA＋３ul转染试剂至无酶EP管中, 混匀后室温静置,２０min后均匀加入６孔板一个孔中,摇晃均匀后放入培养箱中培养.培养２４h、４８h、７２h收细胞,检测siRNA 干扰效率.(２)RNA 提取 　　２．１　细胞处理好后,去除培养基,往六孔板中加PBS洗__________一遍细胞,去除PBS, 加入１mltrizol,室温放置２min,将trizol转移至无RNA 酶的EP管中.２．２　加入氯仿２００ul,用力振摇１５s,室温静置１５min,离心(４℃,１２,０００g,１５min)．２．３　离心后液体分为三层,小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中.２．４　加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置５min,离心(４℃,１２,０００g,１０min).２．５　去上清,沉淀加入７５％乙醇１ml,轻微振荡１５s,离心(４℃,７,５００g,５min)２．６　小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥３－５min．最好是用枪头吸取上清,尽量除去.２．７　加入５０mu;lDEPC水溶解,nanodrop检测浓度,－８０℃冰箱保存.２．８　逆转录２(．９　荧光定量PCR ３)细胞侵袭实验 　　 　　３．１　消化SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞,在六孔板中每个孔种２times;１０５个细胞,培养第二天转染NC和siRNA,培养２４h.３．２　Transwell小室制备:用５０mg/LMatrigel１:５稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,３７℃培养箱中放置１小时凝固.３．３　制备细胞悬液:制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿１２h,进一步去除血清的影响.消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗１－２遍,用无血清培养基重悬.３．４　接种细胞:上室接种无血清细胞悬液,每孔接种量为５００００个,下室加入含血清培养基.常规培养２４h.３．５　培养２４h