人表皮生长因子（hEGF）的原核表达研究.pdfVIP

摘 要 1960年Cohen首次从小鼠领下腺中发现了表皮生长因子，之后的40几年又陆续在 人体和哺乳动物中发现了与表皮生长因子结构与性质相近的生长因子，转化生长因子。 (transforminggrowthfactora，TGFa)、牛痘病毒生长因子 (vacciniagrowthfactor, VGF)、休普氏纤维瘤生长因子 (shopefibromagrowthfactor,SFGF)、粘液瘤生长因子 (myxomagrowthfactor,MGF)、两性调节蛋白(ampiregulin)、双向调节素(arnphireguli, AR),betacellulin(BTC)、表皮调节素(epiregulin,EPl)、结合肝素的EGF样生长因子 (heparin-bingingEGF-likegrowthfactor,HB-EGF)、痘苗病毒生长因子((vacciniavirus growthfactor,VVGF)等，大小都在5080个氨基酸之间，在一级结构上有20%^90% 的同源性，它们都含有六个半肤氨酸，形成3对二硫键和表皮细胞生长因子受体结合且具 有相似的生物活性，构成了表皮生长因子家族。 人表皮生长因子是由53个氨基酸组成的小分子量单链多肤类细胞因子，它对酸和 热稳定。它的显著生物学效应是能够促进内外表皮细胞的生长，在临床上可用于治疗烧 伤、创伤、角膜的移植、胃酸、十二指肠溃疡等;还可用于化妆品。由于其具有特殊的 生物学效应使其有很大的潜在经济效益。 本实验运用RTPCR技术从人胎盘组织中获得了人表皮生长因子的cDNA，将其分 别克隆至PGEX-4T1和PGEX-6P-1融合表达载体中，转花入BL21-CodonPlusTM-RIL; BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌，该宿主菌带有稀有tRNA额外基因拷贝，解决了大肠 杆菌密码子偏爱性问题，不需要附加程序就可以编码稀有密码子的重组基因。表达产物进 行光密度扫描，目的蛋白占总菌体蛋白的30%左右。表达产物主要以包涵体的形式表达。 收集并溶解包涵体后，在还原型谷肌甘肤存在下进行复性，之后过 Glutathione SepharoseTM4B柱，分离纯化得到有生物活性的重组人表皮生长因子。以兔抗人EGF单 克隆抗体为一抗，进行Westernblotting鉴定，证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋 白。表皮生长因子为无血清细胞培养培养基的成分，采用添加试验证明分离纯化得到的 融合蛋白具有良好的hEGF生物学活性。 关键词:人表皮生长因子 PGEX-4T1;PGEX-6P-1;.BL21-CodonPlusTK-RIL;BL21- CodonPlusTm-RP;分离纯化;活性鉴定 Abstract SinceCohenfirstlydiscoveredepidermalgrowthfactor(EGF)rfomamousein1960, manygrowthfactorshaveidentifiedoneafteranothermainlyrfomhumanandmammilla after40yearssuchastransforminggrowthfactora(TGFa)、vacciniagrowthfactor(VGF), Shopefibromagrowthfactor(SFGF)、myxomagrowthfactor(MGF)、ampiregulin、 arnphireguli(AR),betacellulin(BTC)、epiregulin(EPI)、heparin-bingingEGF-likegrowth factor(HB-EGF),vacciniavirusgrowthfactor(VVGF)ect.Theyhave50-80aminoacidsand homologyabout20%--90%inprimarysturcture.Intheirmoleculestherehaveconservatively sixcysteines,whichformthreedisulfidebonds,maketheirbindtoEGFreceptorinducing similarbiologicalactivity.ThesemoleculesaredefinedasanEGFfamily. Humanepidermalgrowth