应用代谢工程超量生产１，６－二磷酸果糖研究.pdfVIP

门口.阅曰.曰. 叭一 ，一 . 应用代谢工程超量生产1,6一二磷酸果糖 应汉杰 欧阳平凯 (南京化工大学生物工程与科学系 南京 210009) 摘要 本文在代谢工程理论的指导下利断了FOP合成途径中的结点和卧性结点，并用化学调节因子调节代 谢流1的分配s.AI生产FDP 实脸发现，ADP合成途径中 “P,FDP和PEP分支点为主要结点，其中PEP结点 ‘ 为刚性结点.用化学调节因子调节代谢流童后，FDP的不积流贵从16.1上升到们 9,FDP对萄萄粉和碑故盐的 转化率从14.3%和41.2%提高,l141.1%和92.7%. 关健词 代谢工程 1.6一二礴政幕枪 超全生产 1,6一二磷酸果糖 (Fructose-1,6-diphosphate，下称FDP)是糖酵解过程中的中间代谢产 物，具有调节搪代谢中若干酶活性之功效， 、改善细胞代谢的分子水平药物，广泛用于医 药和保健等行业“Pi 发现FDP以来，许多科学家对FDP的制备技术 。自1908年H本rden和 作了许多研究1441.但由于缺乏有效的实验技术，’1FDP对葡萄塘和磷酸盐的转化率一直不高。因 璐 为糖酵解过程中各代谢产物、能 (ATP)和还原力 (NADH)以近似于化学计量的速率被合成， 因此它本身不可能适合于FDP的 量生产。而若怨打破原代谢平衡，在胞外大量积累FDP，必须 对处在平衡状态下的原代谢中的 要分支点的嵌分配作较大的变动，这势必会受到保持代谢流 分配最适生长的酶控机制的对抗 ‘为此，本文在代谢工程理论的指导下判断代谢网络和主要结点 的类型，对主要结点的柔刚性进番评估，并用孵 调节因子调节代谢途径流量以超量生产FDP. 近年来，国外对代谢工程 (途径工程)的研究方兴未艾。Stephanoulous研究了代谢流的 分配，关键交叉点的速度限制步导的确定以及9fk途径的合成;Stephanolous和Vallino`0，研究 了利用代谢工程超量生产代谢物(如L-赖氨酸)的方法;Bailey则阐述了代谢工程的设计、 潜力和应用进展。他们的研究为敬谢工程的发属奠定了基础。代谢工程与传统的代谢调控的主要 差异在于代谢工程是对代谢网 进行有目的喇0饰使得基本的代谢途径适于特定代谢物的生 产，其将代谢途径中的各步生化 :应作为一个俞L整体一一弓弋谢网络来看待。它主要与新代谢途 径的建立、途径的热力学可能性 限制结点的fft以及所涉及的酶反应有关。显然这种方法更有 利于从整体上把握研究方向。目 代谢工程技未已广泛用于改变分叉代谢途径的流向，阻断副产 产生新的一藉 产物或者利用新的底物构建新的代谢途径合成 物的合成以及延伸原来的代谢mss 具有新化学结构的代谢产物的研究ts7但国内对代谢工程用于超量生产化合物的研究还刚起步。 1实验方法 1.1G6P结点柔刚性的判断 在两只500m1的三角瓶中，分别加入300m10.7mo1儿葡萄糖、0.5mo1/L磷酸盐、1096酵母 和6%甲苯，在一只三角瓶中加入50mmo1/LMgCl,，另一只不加M9Ch，在371C搅拌反应至结束， 测定葡萄糖和磷酸盐的消耗以及G6P和FDP等糖代谢的中间产物，并计算代谢流量。葡萄糖、磷 酸盐、G6P.F6P和FDP等物质的测定见文献[10-131 1.2FDP结点柔刚性的判断 在两只500m1的三角瓶中，分别加入。.7moVL葡萄糖、0.5mol几磷酸盐、10%酵母、6%甲 苯和50mmol几的MgCl2，在一只三角瓶中加入0.5mmol几EDTA，另一三角瓶中不加EDTA，在 37℃搅拌至反应结束，测定葡萄糖和磷酸盐的消耗以及G6P和FDP等糖代谢的中间产物，并计 算代谢流量。 1.3代谢流量的改变 取100g处理过的酵母细胞，加入II含有。.5mol/L葡萄糖，0