华大基因 测序技术基础原理.ppt

Sanger测序技术原理 第二代测序技术原理 第三代测序技术原理 第二代测序技术小结 454测序仪： 454测序仪使用的方法，经微乳液PCR发扩增后，携带有大量模板分子的微珠被放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序，每一轮测序反应都会掺入一个核苷酸，随后加入反应试剂荧光素和腺苷酰硫酸。这样在每一个小孔中每当有聚合酶将核苷酸掺入到模板上都会发光。最后用腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤去掉多余的核苷酸。 (对重复序列如poly A的测定不准确，因荧光信号具有累加效果) Solexa测序仪：Solexa测序仪使用桥式PCR直接在芯片进行模板扩增，然后同时加入四种经过修饰的脱氧核苷酸，每一个核苷酸都携带一种荧光集团和一个可被去除的终止基团。经过修饰的DNA聚合酶催化引物延伸测序反应。采集图像、然后切除荧光标记基团和终止基团，重复上述反应，完成测序。（边合成边测序） Solid测序仪：Solid测序仪使用微乳液PCR法扩增模板片段，然后吸附有大量扩增片段的直径1um的磁珠倍制成高密度测序芯片，借助使用连接酶而不是聚合酶测序法完成测序。在solid测序一中，每一次反应都会在引物末端加上一个荧光标记的8bp的探针，在探针中央的两个碱基上标记有荧光基团，探针被连接上之后发出荧光，随后荧光基团部分被切除，重新系下一轮反应。（边连接边测序） Current popular sequencing platform 斯坦福大学的科学家最近利用Helicos Biosciences的Heliscope单分子测序仪，对一名白人男子的基因组进行了测序，文章发表在最新一期的《Nature Biotechnology》在线版上。利用一台Heliscope测序仪和4次数据收集运行，完成了此次测序。 研究人员报告称，他们产生了数十亿个Heliscope序列读取，覆盖了90%的人参考基因组，覆盖度达28倍。序列读长为24到70个碱基，平均读长为32个碱基。到目前为止，他们已经鉴定出280万个SNP和752个拷贝数变异。 测序花了4个星期的时间，试剂花费为48000美元  一个lane上分为128格，精确根据X、Y坐标定位每个tile上的每个簇，照相 加入FF dNTPs，用酶反应，去阻断 Single read 的PCR成簇：一般35个反应 Paired end 的PCR成簇：一般25个反应，因为通常扩增片段较长，桥式时跨度较大，形成的光斑信号也较大。 PE有利于测 重复序列，Poly序列等 最多可读150bp，但准确性会降低。 Single read Paired end 切割位点位置 靠近前段 靠近末端 可逆性 化学(甲酰胺)切断，不可逆 酶切阻断，可逆 激发荧光：红光——识别A、C 绿光——识别G、C 一个cycle照4次相：结合滤光镜，每张相片识别一种碱基，后将4张照片叠加，得到如上示的彩图。 2.Emulsion Based Clonal Amplification Clonally-amplified sstDNA attached to bead sstDNA library Anneal sstDNA to an excess of DNA capture beads Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors Break microreactors, enrich for DNA- positive beads Clonal amplification occurs inside microreactors 3.Loading DNA Beads into the PicoTiter?Plate dNTP PPi PPi + APS ATP ATP + Luciferin luciferase Oxyluciferin + Light 4. Sequencing The sequencing instrument consists of the following major subsystems: (a) a fluidic assembly， (b) a flow chamber that includes the