华大基因 测序技术基础原理.ppt

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华大基因 测序技术基础原理

Sanger测序技术原理 第二代测序技术原理 第三代测序技术原理 第二代测序技术小结 454测序仪: 454测序仪使用的方法,经微乳液PCR发扩增后,携带有大量模板分子的微珠被放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序,每一轮测序反应都会掺入一个核苷酸,随后加入反应试剂荧光素和腺苷酰硫酸。这样在每一个小孔中每当有聚合酶将核苷酸掺入到模板上都会发光。最后用腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤去掉多余的核苷酸。 (对重复序列如poly A的测定不准确,因荧光信号具有累加效果) Solexa测序仪:Solexa测序仪使用桥式PCR直接在芯片进行模板扩增,然后同时加入四种经过修饰的脱氧核苷酸,每一个核苷酸都携带一种荧光集团和一个可被去除的终止基团。经过修饰的DNA聚合酶催化引物延伸测序反应。采集图像、然后切除荧光标记基团和终止基团,重复上述反应,完成测序。(边合成边测序) Solid测序仪:Solid测序仪使用微乳液PCR法扩增模板片段,然后吸附有大量扩增片段的直径1um的磁珠倍制成高密度测序芯片,借助使用连接酶而不是聚合酶测序法完成测序。在solid测序一中,每一次反应都会在引物末端加上一个荧光标记的8bp的探针,在探针中央的两个碱基上标记有荧光基团,探针被连接上之后发出荧光,随后荧光基团部分被切除,重新系下一轮反应。(边连接边测序) Current popular sequencing platform 斯坦福大学的科学家最近利用Helicos Biosciences的Heliscope单分子测序仪,对一名白人男子的基因组进行了测序,文章发表在最新一期的《Nature Biotechnology》在线版上。利用一台Heliscope测序仪和4次数据收集运行,完成了此次测序。 研究人员报告称,他们产生了数十亿个Heliscope序列读取,覆盖了90%的人参考基因组,覆盖度达28倍。序列读长为24到70个碱基,平均读长为32个碱基。到目前为止,他们已经鉴定出280万个SNP和752个拷贝数变异。 测序花了4个星期的时间,试剂花费为48000美元 一个lane上分为128格,精确根据X、Y坐标定位每个tile上的每个簇,照相 加入FF dNTPs,用酶反应,去阻断 Single read 的PCR成簇:一般35个反应 Paired end 的PCR成簇:一般25个反应,因为通常扩增片段较长,桥式时跨度较大,形成的光斑信号也较大。 PE有利于测 重复序列,Poly序列等 最多可读150bp,但准确性会降低。 Single read Paired end 切割位点位置 靠近前段 靠近末端 可逆性 化学(甲酰胺)切断,不可逆 酶切阻断,可逆 激发荧光:红光——识别A、C 绿光——识别G、C 一个cycle照4次相:结合滤光镜,每张相片识别一种碱基,后将4张照片叠加,得到如上示的彩图。 2.Emulsion Based Clonal Amplification Clonally-amplified sstDNA attached to bead sstDNA library Anneal sstDNA to an excess of DNA capture beads Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors Break microreactors, enrich for DNA- positive beads Clonal amplification occurs inside microreactors 3.Loading DNA Beads into the PicoTiter?Plate dNTP PPi PPi + APS ATP ATP + Luciferin luciferase Oxyluciferin + Light 4. Sequencing The sequencing instrument consists of the following major subsystems: (a) a fluidic assembly, (b) a flow chamber that includes the

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