血液RNA提取.docVIP

完全可以,我曾经全血标本6个小时后分离白细胞提RNA,结果很好.因为你提的是白细胞内的RNA,因而在细胞没破损前,一般情况下不会出现RNA的降解,当你开始加TIIZOL时,你的所有器材的处理尤其重要,因而放心的做吧,本人长期从事白血病融合基因的检测，曾经使用4度保存3天的血液进行RNA提取，效果同样非常满意，目前使用的一次性耗材基本上不用DEPC水处理，只要注意规范操作，按TIIZOL说明书操作，提取的RNA质量同样非常的高。附上本试验室的简易操作程序：1．??外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（1）??外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。（2）??加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；（3）??加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。（4）??吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。离心1500rpm 20min。（5）??用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70冻存，或直接提取RNA（可以先进行细胞计数以保证细胞数）。2．??利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Trizol说明书）以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。尽量快地进行操作，减少RNA降解。（1）??先加1ml Trizol于1×107细胞中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-10min。（可-70，1月）（2）??加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡（vigorously） 15s，室温静置2-3min。（3）??在4下1,2000g离心15min。（4）??小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管（注意不要抽到蛋白层），加入500μl异丙醇（专用），颠倒混匀（不要太剧烈），室温静置10min（RNA沉到底部）。（5）??4 1,2000g离心10min，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质（RNA）。（6）??加入1ml 70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇。（7）??4 7500 g离心5min，去除乙醇（尽量用枪头吸干净）后晾5-10min，不要太干,否则难以溶解。RNA可以在70%乙醇中-80保存1年。最新血液RNA提取！！！！ 1、血液收集：最好用肝素抗凝，因为EDTA可能会对后续的pcr有影响，因为EDTA会螯合pcr反应中的Mg2+，也可以根据实验的具体要求看选择怎么样的抗凝。 2、白细胞的分离：一般选择1.5ML新鲜的血液，或选取冷冻的5ML的血液（冷冻血液的保存：先液氮速冻，再置于-80°保存），或隔天的5ML的血液，就可以分离到比较多的白细胞了。可以选择溶红素（BD公司的）或红细胞裂解液按一定的比例（1：3或1：5）分离白细胞，一般在3500转离心6分钟即可，效果不好的话，可以重新裂解一次。分离得到的白细胞，立刻用质量好的TRIZOL裂解白细胞，如果不能马上提取的话，可以置于-20或-80°保存，过后抽提。 3、RNA抽提：选择一般的组织或细胞的RNA抽提试剂盒即可。 本方法简单，省钱，经过大量的实验表明是可行的，并且本人用进口的血液RNA抽提试剂盒都不能跟上述方法比！！！ 在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80保存，即使在-80保存，全血中的RNA也容易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施。作为RNA提取的领先公司，北京艾德莱的研发人员在05年国内首家研发成功液体样本RNA提取试剂RN01 TRIpure LS(LS 意思是Liquid Sample。可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。 在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。然后可把此裂解液保存在-20下可达2个月，-80可达半年。在此期间，可以把该裂解液运输到北京艾德莱生物公司进行RNA的抽