大鼠分娩相关新基因的克隆、表达和分析.pdfVIP

摘 要 哺乳动物和人类的分娩是一个复杂的程序化生理过程，受到包括激素基因在 内的多种基因在时空上的精确调控。由于分娩的确切机制在分子生物学水平上还 不十分明了，临床上至今对孕妇早产没有理想的的检测、预防和治疗方法。子宫 平滑肌在妊娠的绝大多数时间保持静止状态，而在妊娠的末期活化并进行强有力 的收缩直到把胎儿推出体外。研究在分娩时的基因表达变化可以从分子水平展示 分娩发生机制。在前期工作中我们运用DNA微阵列 M〔icroarray)技术观察了大 鼠从妊娠中期到分娩前子宫平滑肌基因在rnRNA水平上的表达变化，发现在检测 的8799个基因中，有349个基因在分娩前表达显著变化，而其中54个是序列和 功能都未知的基因表达片段 (EST)。深入研究这些未知基因的序列、结构和功能 会有助于理解和阐明早产的机制。 本研究选择了两个在大鼠临产前表达水平有显著变化 EST片段 (AA891826 和311291446)进行了相对系统的深入研究。首先通过 5-RACE克隆方法得到两 个基因的cDNA全长，其中一个EST(AA891286)的全长为1.7Kb，编码一个317 氨基酸的蛋白;另一个 EST(311291446)的序列含两个转录本，分别长 1.6kb和 1.2kb，但他们的读码框相同，均为323氨基酸的蛋白。这两个新基因被分别命名 为分娩相关基因 (ParturitionRelatedProtein)PRP1(GenebankNo.AY185508)和 PRP2(GenebankNo.AY185507)oDNA同源比较还发现PRP1同人和小鼠的 Tacstd2基因高度同源 〔同小鼠的Tacstd2基因同源性达93%)，而PRP2基因是 一个在DNA数据库里没有任何显著同源性的全新基因。 通过比对大鼠基因组序列数据库，将PRP1基因定位于4号染色体，PRP2基 因定位于 1号染色体。基因组信息显示PRP1基因为单外显子基因;PRP2基因有 4个外显子，基因全长约 IOkb。蛋白结构预测显示PRP1是一个单跨膜蛋白;而 PRP2有4个跨膜区域，其拓扑结构同连接蛋白的结构相似。对启动区域的转录因 子结合位点分析表明两个基因受到Spl.USF,AP2等许多转录因子的调控，特别 是二者启动区均存在多个GR(糖皮质激素受体蛋白，GlucocorticoidReceptor) 的结合位点，PRP1基因还存在2个IL-6结合蛋白的结合位置，这预示着PRP1 和PRP2可能也受到糖皮质激素和细胞因子IL-5的调控表达。 Northem杂交结果显示PRP1在妊娠16天、18天、20天几乎没有表达，而在 妊娠22天(临产前)时表达显著;PRP2在妊娠16天、18天、20天均有表达，但妊 娠22天((1-[1b产前)时的表达显著增加，同时Westem杂交实验也证明了PRP2的这种 表达变化，而且还显示分娩后表达急剧下降，这表明PRP1和PRP2均同分娩有密 切的相关性。 通过原核表达，我们得到了PRP2基因的融合蛋白和相应的兔抗血清，并进 行子宫平滑肌的组织定位分析。结果显示在妊娠22天的大鼠子宫平滑肌组织有明 显的杂交信号，并将PRP2初步定位于细胞膜上。而妊娠 16天的大鼠子宫平滑肌 组织几乎没有杂交信号。 通过这些研究，我们初步完成了PRP1和PRP2基因的结构和功能分析，并且 通过研究表明PRP1和PRP2可能分别通过其在钙信号转导途径和细胞间通讯中的 作用参与分娩过程，这将为进一步分析这些基因功能奠定基础。 关键词:大鼠:分娩:早产;分娩相关蛋白 Abstract Parturitionofmammalianandhumanisacomplexphysiologicaland programmabledprocedure，anditisregulatedbymanygenesat temporal-specialand tissue-speciallevel.Because themolecular mechanismofparturitionisstillunknown,thereisnoperfectmethodto detect,preventandtherapypreterm delivery.Myometrium keeps quiescenceatalmostwholegestation,butitw