蛋白质的免疫共沉淀的研究与发展.docVIP

附件4 呼和浩特职业学院毕业论文(设计) 学院名称:生物化学工程学院 年 级:2009 学 号:0930506224 论文编号: 题 目：蛋白质免疫沉淀的技术研究发展 专 业: 生物技术及应用 学生姓名: 吴靖 学 号： 0930506224 完成时间： 2012年03月01日 指导教师： 吴娜 二零一二年三月 蛋白质免疫沉淀的技术研究发展 【摘 要】免疫沉淀技术是检测蛋白质相互作用的经典方法，也是较常用的方法，文章对近10余年有关免疫沉淀技术原理和应用及优缺点的分析进行文献综述。 关键词： 免疫沉淀；蛋白质；相互作用；技术 正文 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件，如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质见的相互作用可改变细胞内蛋白质的动力学特征。如底物结合特性、催化活性；也可产生新的结合位点，改变蛋白质对底物的特异性；还可失活其他蛋白质，调控其他基因表达。因此，只有使蛋白之间的相互作用顺利进行，细胞的正常生命活动过程才有保障。由于蛋白之间的相互作用具有如此重大的意义，因此，其检测方法的研究也备受重视，由生化方法，如蛋白质亲和层析、亲和印迹、免疫沉淀及交联，发展到当今的分子生物学方法，如以基因文库为基础的蛋白探测、噬菌体显示及双杂交系统等，另外还发展了可定性定量检测蛋白质相互作用的简便又快捷的方法，如表面胞质团共振等。通过这些方法的联合使用，实验得出的蛋白之间的相互作用的结论显的更为可靠。 　1 免疫沉淀的基本原理 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。　　其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀 酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清； 　　（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； 　　（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； 　　（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； 　　（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； 　　（6）SDS, Western blotting或质谱仪分析。 　　注意的问题： 　　（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 　　（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 　　（3）使用对照抗体： 　　单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 　　兔多克隆抗体：正常兔IgG 利用免疫共沉淀技术验证抗增殖蛋白(PHB)与HSP70间的相互作用,为研究应激时HSP70促进PHB进入线粒体的机制提供科学依据。方法采用Western blot方法检测HEK293细胞中PHB与HSP70的表达。构建抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB,经酶切鉴定正确后,将其转染HEK293细胞,采用荧光倒置显微镜观察转染效率。收集转染的HEK293细