SDS-PAGE及tricine蛋白电泳.docxVIP

蛋白质电泳 SDS溶液配制Tris 缓冲液（1.5 M， pH 8.8）90.86 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至8.8，定溶至500 ml。Tris 缓冲液（1.0 M， pH 6.8）60.57 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至6.8，定溶至500 ml。30% 丙烯酰胺29 g 丙烯酰胺1 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于60 ml水（可用37 ℃水浴溶解），定溶至100 ml，过滤后装入棕色瓶，放置4℃保存。10% SDS20 g SDS溶于200 ml水。5× Tris 甘氨酸缓冲液15.5 g Tris （1×: 25 mM）94 g 甘氨酸（1×: 250mM）5 g SDS （1×: 0.1%）或者加50 ml 10% SDS溶液定容至1 L，使用时稀释5倍。5×SDSLoading Buffer1.25 ml 1M Tris-HCl? pH6.8（终浓度：250 mM）0.5 g SDS （终浓度：10%）25mg 溴酚蓝（终浓度：0.5%）2.5 ml 甘油（终浓度：50%）350 mg 二硫苏糖醇DTT（终浓度约为500 mM）加入去离子水溶解后定容至5 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。5×SDSLoading Buffer0.6 ml 1M Tris-HCl? pH6.8（终浓度：60 mM）2 ml 10%SDS （终浓度：2%）1ml 1%溴酚蓝（终浓度：0.1%）5 ml 50%甘油（终浓度：25%）0.5 ml 巯基乙醇（终浓度约为14.4 mM）加入去离子水溶解后定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。2×SDSLoading Buffer 1.25 ml 1M Tris-HCl? pH6.80.2 g SDS 0.25 ml 巯基乙醇2.5 ml 甘油0.05 ml 2% 溴酚兰（溶于乙醇）1.9 ml H2O定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。5×SDSLoading Buffer （非还原）0.4 ml 1.5 M Tris-HCl? pH8.82 ml 10% SDS10 mg 溴酚蓝2.5 ml 甘油5.1 ml H2O定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。染色液（100 ml）45 ml 甲醇 or 乙醇10 ml 乙酸0.25 g Coomassie Brilliant Blue R-250定容至100 ml。洗脱液30% 甲醇 or 乙醇10% 乙酸Tricine SDS溶液配制正极缓冲液anode buffer（1×）0.2 M Tris (pH 8.9)：12.114 g加H20定容至500 ml, 4 ℃保存。负极缓冲液 cathode buffer（1×）0.1 M Tris + 0.1 M Tricine + 0.1% SDS 不用调pH：6.057 g Tris + 8.96 g Tricine + 0.5 g SDS 加H20定容至500 ml, 4 ℃保存。凝胶缓冲液 gel buffer（G-B, 3×）36.342 g Tris + 0.3 g SDS加H20定容至100 ml, HCl调pH = 8.45，过滤4 ℃保存。AB-3 储存液（49.5% T, 3% C mixture）24 g丙烯酰胺 + 0.75 g甲叉双丙烯酰胺，加H20定容至50 ml，过滤4 ℃保存。AB-6储存液（49.5% T, 6% C mixture）23.25 g丙烯酰胺 + 1.5 g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml，过滤4 ℃保存。制胶配方10%分离胶（8 ml）1.6 ml AB-62.67 ml 3× gel buffer1 ml 50%甘油2.73 ml 水0.04 ml 10% APS0.004 ml TEMED4% 积层胶（4 ml）0.33 ml AB-31 ml 3× gel buffer2.67 ml 水0.03 ml 10% APS0.0033 ml TEMED电泳操作制胶同SDS。电泳：在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液。用30 V的电压预电泳10分钟，然后上样。开始电泳。电压30 V。当蓝色染料从积层胶进入分离胶