精选实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定.pptVIP

实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定 * 一、实验目的 1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法 * 二、实验重点难点 2.1、双缩脲反应及茚三酮反应的实验原理 2.2、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加顺序 2.3、茚三酮反应中颜色变化过程 2.4、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲线制定 * 三、实验原理 3.1、概括 蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。 氨基酸的基本结构为： 蛋白质的主要连接方式为： 不变部分 可变部分 * 3.2 蛋白质与氨基酸的颜色反应总结 反应名称 反应基团 反应操作 反应产物及现象 用途 双缩脲反应 肽键 NaOH及CuSO4 1ml样+2ml0%NaOH+2d CuSO4 Cu –Cu—双缩脲络合物（兰紫色） 测蛋白质含量 鉴定蛋白质水解 是否完全 茚三酮反应 α-氨基酸 0.5ml茚三酮试剂+1ml样 兰紫色 测AA含量检验AA及蛋白质 黄色反应 苯环、Try、Tyr 1ml样+3~4d浓HNO3 观察再加NaOH，再观察 黄色硝醌酸生成 鉴定Try、Tyr 坂口反应 胍基 样1ml+5d15%NaOH+2d1% α-萘酚+6d次溴酸钠 玫瑰红色产物生成 鉴定Arg 测定Arg含量 乙醛酸反应 吲哚环 样1ml+2ml冰乙酸+浓HSO4 (沿壁且不能混匀)微热 中间生成兰紫色环 鉴定Try 偶氮反应 咪唑基 样1ml+偶氮试剂 与20%NaOH1ml 有橙色和鲜红色产物 生成 鉴定His、Tyr 醋酸铅反应 巯基、CyS CySH 0.5%Pb(AC)2+10%NaOH+1ml样+加热后再加HCl闻其味 黑色PbS生成 臭鸡蛋味 鉴定含硫AA CyS、CySH * 3.3、双缩脲反应 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。 含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。 这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。 * 双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。 * 3.4、茚三酮反应 C 2 C H C C C O O H O H 2 C C O O H R C C C O O O H O H 还原茚三酮 茚三酮 水合茚三酮 O NH3 R O + + + + H N H 水合茚三酮 茚三酮 还原茚三酮 篮紫色化合物 茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在.β-丙氨酸、氨、许多一级胺呈正反应。 在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。 * 3.5、米伦氏反应（Millon反应） 苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2 、醇或碱，因它们能使汞变成沉淀，中和碱时不能用HCl） * 3.6、黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橘黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 例如皮肤、指甲、毛发等遇浓硝酸变黄。 * 3.7 常用测定蛋白质浓度的方法 凯氏定氮法：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生