利用木糖_葡萄糖为原料产乙醇酵母的筛选_鉴定及发酵试验.docx

利用木糖2葡萄糖为原料产乙醇酵母的筛选、鉴定及发酵试验333杨登峰潘丽霞关妮米慧芝左文朴黄日波(广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心南宁530003)摘要建立筛选利用木糖为碳源产乙醇酵母模型,获得一株适合利用木质纤维素为原料产乙醇的酵母菌株。样品经麦芽汁培养基培养后,以木糖为唯一碳源的筛选培养基初筛,再以重铬酸钾显色法复筛。通过生理生化和26D1/D2区对筛选得到的菌株进行分析和鉴定,该菌初步鉴定为Pichiacaribbica。经过筛选得到的菌株Y223以木糖(40g/L)为唯一碳源发酵时:生物量为23.5g/L,木糖利用率为94.7%,乙醇终产量为4.57g/L;以混合糖(葡萄糖40g/L,木糖20g/L)发酵时:生物量为28.6g/L,木糖利用率为94.2%,葡萄糖利用率为95.6%,乙醇终产量为20.6g/L。Pichiacaribbica是可以转化木糖及木糖2葡萄糖混合糖为乙醇的酵母菌株,为利用木质纤维素发酵乙醇的进一步研究奠定了基础。关键词乙醇木质纤维素筛选鉴定中图分类号Q939二十一世纪以来,“资源与环境”、“清洁能源、替代能源”、“新能源、太阳能、生物质能”等新概念已经深入人心。资源综合利用与环境保护是构建和谐社会以及可持续发展的永恒主题;能源问题亦成为世界关注的焦点,并上升到国家的安全战略,控制一次性能源、开发可再生能源和新能源、节约能源成为世界各国的国策之一。由于石油等矿石能源的日益短缺,当今世界正处于由矿石能源向可再生能源过渡的时期,可再生能源替代矿石能源已经成为世界发展的必然趋势。由于石油等矿石能源的价格日渐飞涨,可再生能源的优势日益显现。现在许多国家都积极发展燃料乙醇产业,以降低对石油的依赖。微生物利用木质纤维素生产燃料乙醇,被认为是一种利用这一廉价而又丰富资源的合理方法[1]。木质纤维素中含有较高的木质素和纤维素、半纤维素,其中纤维素主要由葡萄糖构成,而半纤维素主要由以木糖为主的五碳糖构成[2],它们是自然界最丰富的可再生资源。目前应用于乙醇工业化生产的菌株主要是酿酒酵母,而酿酒酵母本身不能利用木糖产生乙醇,为了有效利用木质纤维素生产燃料乙醇,需要可以利用木糖产乙醇的菌种。同时由于木质纤维素结构复杂,对纤维素和半纤维素进行有效分离,分别水解得到葡萄糖和木糖,资源损失量大、工艺路线长、成本高。因此,当前木质纤维素水解得到同时含有葡萄糖和木糖等单糖的混合糖,是潜在的重要生物转化原料[3]。本文通过从不同土壤环境中分离的酵母菌,建立筛选发酵木糖产乙醇酵母模型,并从自然界中筛选出能够利用木糖、木糖2葡萄糖混合糖产乙醇的酵母菌种,为木质纤维素转化为燃料乙醇打下良好的基础。1材料与方法1.1土壤采集和来源采集广西壮族自治区南宁市郊区6种不同区域和生态类型的土壤,每份样品分别取5～10cm深的3～5个穴的土壤混合,置于无菌封口袋,用于酵母菌的分离收稿日期:2009206202修回日期:20092082173国家自然科学基金、广西科技攻关项目(0537012)资助项目33通讯作者,电子信箱:rbhuang@gxas.cn70中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.29No.102009ml/min,柱温:100℃,色谱柱:phenomenZB2WAXplus。1.7酵母菌的鉴定方法1.7.1酵母菌的形态和显微照相采用水浸片法观察酵母[5],在放大倍数为1000倍的Nikon显微镜下进行显微照相。1.7.2菌丝观察在培养皿内铺2张滤纸、放置灭菌载玻片,其上涂布2ml马铃薯琼脂培养基,完全凝固,用接种环划线接种,盖好灭菌盖玻片,培养皿注入2ml无菌水浸渗滤纸,28℃培养5天,观察菌丝生长。1.7.3子囊孢子形态观察酵母菌划线接种于麦氏琼脂斜面上,28℃培养1～2个星期。在培养皿铺两张滤纸放置灭菌载玻片,其上涂布2ml麦氏培养基待完全凝固后划线接种麦氏琼脂斜面上生长良好的酵母菌,盖好灭菌盖玻片培养皿中注入2ml无菌水浸渗滤纸,28℃培养3天后取出镜检。无子囊孢子形成的酵母菌株,改为20℃培养,每周观察一次,持续6周,记录子囊孢子的形态、个数等特征。1.7.4生理生化鉴定酵母的糖同化实验按照《酵母和筛选。1.2主要试剂仪器D2木糖,葡萄糖,甲酸(色谱纯),乙醇(色谱纯),乙腈(色谱纯),以上药品均购于上海国药集团化学试剂有限公司。Taq酶、DNA限制性内切酶、T4连接酶、pMD182T载体系统购自大连宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。气相色谱仪(6890,美国安捷伦科技有限公司);电子显微镜(YS100,日本Nikon公司);电热恒温培养箱(10122A,上海沪越实验仪器有限公司);净化工作台(SW2CJ21F