纳米医药 第13章－纳米技术载基因转导中的应用.doc

第13章 纳米技术在基因转导中的应用 随着纳米技术及基因转导技术本身的不断发展，纳米技术将在基因转导过程中发挥更大的作用。本章通过论述纳米技术在基因转导中的应用来阐述纳米生物学的相关内容。 13.1 常用基因转导方法 基因转导是在分子水平上对基因进行遗传操作的一种手段。一个基因经标记、定位并被克隆后，人们总希望将其导入不同类型的细胞中，以研究外源基因的整合、调控、表达的遗传规律以及分离其特定的基因产物等。为了研究基因的结构与功能的关系，就必须建立有效的DNA导入细胞的方法。现已有多种方法可将DNA直接或间接地导入细胞，这些方法可分为物理方法（如基因枪法[]、碳化硅纤维法[]、显微注射法[]等）、化学方法（如高分子复合物介导法、PEG法[]及磷酸钙法[]等）、生物方法（如脂质体法[]、农杆菌法[]、真菌游走孢子介导法[]及花粉管法[]等）和生物物理方法（如电击法[]和激光介导法等）。这些方法大多可以借助纳米载体协助完成基因转导过程。故本节对它们作了较详细的介绍。 13.1.1 物理方法 1．基因枪法 基因枪转导法又称粒子轰击技术(Particle bombardment)或称生物发射技术(Biolistic process)、高速微粒子发射技术(High-velocity microprojectile)，它是将载有外源DNA片段（基因）的金或钨等微粒加速后在真空状态下射入受体细胞中的一种遗传物质在物种间或物种内的转导技术。加速的动力通常是通过高压气体、高压放电或火药爆炸加在粒子上的瞬时冲量等。1987年美国康奈尔大学的Sanford等[]首先发明了火药式基因枪，随后该实验室的Klein等[]使用该基因枪将携带有细菌氯霉素乙酰转移酶基因(cat)的烟草花叶病毒的RNA导入洋葱表皮细胞，使cat基因在洋葱中得到表达。1990年美国BioRad公司根据Sanford等的研究推出商用基因枪PDS-1000/HE系统，随后基因枪法在基因转导中得到广泛应用。与此同时，高压放电[]、压缩气体驱动[]等各种类型基因枪也相继出现，并在反复实践中得到改善和发展，其改进的核心是粒子加速系统，目的是提高射弹的可控度(粒子的运动速度和射入的深度等)。这些改进不但提高了微粒轰击法基因转导的效率，而且结果的可重复性也得到了提高。但是，所有的这些方法都是基于同一个原理，即将钨粉或金粉微粒加速到很高的速度使之穿透植物细胞壁，或其它类型细胞的核或具有DNA序列的质粒的外围蔽障。微粒轰击技术的出现是禾谷类植物的遗传转化取得重大进展的标志。现在，主要的禾谷类作物，如水稻、玉米、小麦[]和大麦等，都已通过基因枪法进行了成功的转导，并得到目的基因正确表达的转基因植株。Zhou等[]用基因枪法将耐草甘膦土壤杆菌属CP4草甘膦氧化还原酶(GOX)基因转导到小麦幼胚中，获得了耐草甘膦的转基因小麦植株。Barro等[]和何等[]用基因枪法将编码高分子量麦谷蛋白亚基的基因(1Ax1和/或1Dx5)导入普通小麦和硬粒小麦中，获得表达外源目的基因的转基因小麦，面筋功能分析表明，由转基因小麦加工得到的生面团的弹性显著增加。用于基因枪转化的材料，通常分为两种，一种是愈伤组织，一种是新分离的外植体。如果受体具有很好的再生能力如水稻，其愈伤组织可以用作基因枪转化的受体材料，然后在合适的选择压力下培养筛选转化体。而对于小麦等禾谷类离体细胞（组织）高频再生较困难的材料，则可直接对新分离的外植体如幼胚或幼穗等立即进行基因枪转化，或者在培养几天后用基因枪转化。这些组织可产生大量具有再生能力的培养细胞，并通过体细胞胚胎发育再生出植株，在体细胞胚胎发生的过程中应用适当的筛选策略就可以区别出转化体。此外，在大豆和大麦转化中用芽或吸涨的种子的分生组织区进行轰击，但不进行筛选，只在再生出植株后进行分子鉴定也获得成功。 选择剂是区分转化体和非转化体的快速有效的手段，因此选择合适的选择剂及浓度是转化成功的关键因素之一。选择剂的选择以能明确快速区分转化体且对转化体不产生形态、生理及遗传方面的不良影响为标准。例如，禾谷类植物转化细胞成功筛选的条件就与其它类型植物有较明显区别，通常用于双子叶植物转化体的选择剂如卡那霉素和潮霉素在对筛选单子叶植物愈伤组织的选择时效果较差。目前在禾谷类转基因研究中使用最为广泛的选择剂有除草剂-Basta和G418。Basta含有效成分膦丝菌素（Phosphinothricin，PPT）可以在低浓度时杀死未转化的组织。对Basta的抗性可以通过一种编码膦丝菌素乙酰转移酶（Phosphinothricin acetyltransferase， PAT）的抗性基因（bar基因）获得；G418的有效成份为硫酸遗传素(Geneticin Sulphate)。这两种选择剂和抗性基因的组合目前已在禾谷