牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达.pdfVIP

上海 口腔医学 2011年 10月 第2O卷 第 5期 · 454· ShanghaiJoumalofStomatologyVo1．20No5October，2011 [文章编号]1006．7248(2011)05—0454．05 牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达 李昂 ，朱春晖 ，石建峰 ，魏虹 ，刘瑾 。，苟建重 (1．西安交通大学医学院附属El腔医院 口腔医学研究中心，2．牙周黏膜科 ，陕西 西安 710004) 摘【要】目的：构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋 白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子 ，转化于大肠杆菌 BL21中，并 在最适宜条件下诱导表达。方法 ：以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基 因组 DNA为模板 ．利用 PCR技术获得 目的基因 PAD．将扩增得到的PAD基 因定向插入线性克隆载体PMD18-TVector中．得到克隆重组子 PMD18-T—PAD 经PCR和 双酶切鉴定正确的克隆重组子 PMD18-T—PAD与表达载体 PET一28a经Xhol和Ncol双酶切后 ．在一定连接体系下 ．连 接构建表达质粒PET-28a—PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒 PET一28a—PAD，转化大肠杆菌 BL21感受态细胞 ．在不 同浓度异丙基硫代一8一D一半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋 白。以抗 HisTag单克隆抗体为一抗 ．Western免 疫 印迹鉴定 。结果：DNA测序结果表明，PAD与 NCBI核酸数据库 中收录的PAD序列同源性达 100％；37℃，IPTG浓 度为 0．5mmol／L．250r／rain振摇培养6h的诱导条件下，PAD可高效表达 。结论 ：本实验成功构建 了PAD的克隆表达重 组子 ．并在大肠杆菌 中表达 了PAD蛋 白，为进一步研究PAD的免疫学性能及相应 的抗体制备奠定了基础 [关键词】牙龈卟啉单胞菌；肽酰精氨酸脱亚氨酶 ；原核表达 [中图分类号1R781．4 f文献标志码1A Cloning andexpression ofpeptidylargininedeiminaseofPorphyromonasgingivalis LIAng，ZHU Chun—hui，SH1 Jian—feng’，WEIHong’，LIUJin，GOUJian-zhong． ．ResearchCenterofStomatology,2．DepratmentofPeriodontology, SchoolofStomatology,Xi’anjiootongUniversity．Xi’an710004，ShanxiProvince，China) A【bstract】PURPOSE：Toclonethepeptidylargininedeiminase(PAD)geneofPorphyromonosgingivalis gingivalis)and tobeexpressedinE．colunderthebestconditions．METHODS：WithP ngivalisstrainsATCC33277genomicDNA as atemplate，PCR wasapplied to obtain gene PAD which wasthen inserted intolinearcloningvectorPMD-18-T to constructclonerecon．RecombinantPMD18-T-PAD wasclonedandanalyzedwithPCR andrestrictionendonuclease，and PET一28aexpressionvectorwasdigestedby XholandNcol，theirproductswerelinkedtoconstructexpression plasmid PET一28a—PAD undercertainconnectionsystem．Therecombinantexpression plasmidPET一28a—PAD whichhad been confirmed correctlywastransformed t