PCR基本原理与应用.pptVIP

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 Taq 酶的保真性不高 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切活性; 在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。 3、dNTP 的质量与浓度 在PCR反应中，dNTP应为50～200μM，浓度过低会降低PCR产物的产量 注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配 高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 4、模板DNA 模板DNA的来源： —微生物中提取DNA —从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞 —固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 —PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加? 5、Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影