中国家蚕和野蚕抗病毒蛋白Lipase的基因克隆和活性分析研究.pdfVIP

中国家蚕和野蚕抗病毒蛋I兰lLipase的 基因克隆和活性分析 姚慧鹏 曹翠平赵娜夏卓盛周 烈 方 莹鲁兴萌 昊小锋 (浙江大学动物科学学院，杭州310029) cDNA(GenBank登录 摘要：分别从中国家蚕和野蚕中肠内克隆了抗BmNPV病毒的Lipase 分析了两者的同源性，并构建了含有该基因的重组杆状病毒进行重组蛋白表达，分析了该 基因产物的抗病毒活性。从家蚕基因组中克隆获得该基因的全序列(GenBank登录号： DQ286554)，发现全长2126bp，含有4个外显子和3个内含子，对其基因结构进行了分析。 关键词：家蚕；野蚕；抗病毒蛋Lipase；基因克隆与分析 昆虫通过体液和细胞免疫对入侵的病原微生物，如细菌、真菌等能够作出有效的抵抗反应Ⅲ， 特别是对细菌的免疫已有了比较深入的了解【2叫，但是对于病毒的感染昆虫则不能象脊椎动物那样产 生有效的免疫能力嘲。可能是病毒具有变异较快的特点，迄今为止有关昆虫对病毒的防御和控制的 研究报道很少。在70—80年代日本学者曾有过这方面研究，他们用家蚕肠液处理病毒粒子，发现能 明显降低病毒的感染能力，由此推测家蚕肠液中可能存在着某些抗病毒的物质，并初步认为可能是 一种红色荧光蛋白RFPM。除RFP夕b，家蚕中是否还存在着对病毒具有抑制或杀灭作用的物质?近 M．Ponnuvel等报道从家蚕幼虫消化液中纯化了一种 20年来几乎没有新的研究报道。最近Kangayam 蛋白质，它表现出很强的抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的活性圈。从该蛋白质cDNA的氨基酸序列 的同源性推导揭示其与黑腹果蝇的脂肪酶有56％的同源性[91，与人类脂肪酶则有21％的同源性口Ol，推 测是一种脂肪酶，命名为BmLipase。 野蚕是完全野化的昆虫，一直处于日晒雨淋、天敌侵害、农药污染和多种微生物病原等的威 胁，但仍以其强大的生命力在野外生存着，表现出很强的抗逆性和环境适应性。因此，发掘野蚕的 优良性状对家蚕的利用无疑会有重要参考价值。本研究中我们试图从我国的家蚕和野蚕中分别克隆 该基因，分析两者的基因同源性，并通过体外表达分析其抗病毒活性。并首次报道了该基因的全序 列．通过生物信息学的方法解析该抗病毒基因的相关信息。 1．材料和方法 1．1工具酶和试剂 I I、PsfI、EcoR I、蜘n ，曾,RNA抽提用Sangon公司的经典总RNA抽提试剂盒。所用的BamH 等限制性内切酶。以及DNA 盒、DNA回收试剂盒等购自北京鼎国生物有限公司。大肠杆菌DH5et，JMl09感受态细胞为本试验 资助项目： 国家重点基础研究发展计划973x页目(编号2005CB．121003)、浙江省自然科学基金 SRTP项目。 (Y305050)及浙江大学7th、8th 作者简介： 姚慧鹏(1982--)，男，山西，硕士研究生。 通讯作者： 一19— 室保存。家蚕Bac—to—Bac快速杆状病毒基因表达系统由本研究室自行研发[111。重组蛋白纯化参照美 国Invitrogen公司手册。 1．2家蚕中肠后部组织总RNA及基因组DNA：提取 家蚕品种：秋丰×白玉。野蚕从浙江省德清县境内桑园抓获。解剖5龄家蚕、野蚕中肠后部组 织，用Trizol法抽提．营,RNA，用试剂盒抽提基因组DNA。 1．3引物设计与RT—PCR扩增 根据已报道的Lipase：基因序列，在其全序列的外测设计一对引物，家蚕和野蚕都采用同一套引 物，上游引物序列：5’-atgcctgatggcgagggtgttc一3