微囊藻毒素直接竞争ELISA的检测法的初步建立研究.pdfVIP

!!兰星旦堡堡茎墼堡堕堡芝!工查! 微囊藻毒素直接竞争ELISA检测法的初步建立 雷腊梅宋立荣关英松 中国科学院水生生物研究所，武汉市 摘 要 收集滇池微囊蒹球华，拱干，用5强的乙敌抽提微囊藻毒素，最后用HPLC分离树备 毒素，经分析，毒紊纯度为50％左右。将制备所得的微囊藻毒素LR通过EDA与BSA连 接作为抗原免疫昆明鼠．应用直接竞争ELISA法检测待测样品。藻细胞的破碎采用简单 的沸水浴法。结果显示．引起50％抑制率标准品浓度为1．8 ng／mL．线性范围为0．1～10 ng／mL最低检出量为0．2ngtmL，即50Pg。共检测了23个样品，其中20个样品古有毒隶。 关建词：微囊藻毒素，抗体，ELISA 壹、前 言 水体环境富营养化引起的蓝藻水华问题在我国已日趋严重，几大重要的淡水湖泊 如滇池，太湖．巢湖，每年夏秋季都会爆发高浓度的蓝藻水华”…，对水体生态系统和 人类链康带来直接或潜在的严重危害。在我国大多数水体中发生的蓝藻水华，其优势 种类主要是微囊藻，它产生一种被称为微囊藻毒素的环状七肽毒素，研究表明，长期 饮用含有微囊藻毒素的水可诱发肝癌，直肠癌，轻者可使人产生腹泻和皮肤过敏等症 状pJ．微囊藻毒素对人类健康的威胁已引起世界范围学者的广泛关注。 微囊藻毒索是一种细胞内毒素，只有在细胞裂解后才释放到水体中，因而建立可 靠、敏感、快速的检测和分析微囊藻毒素的方法显得极为必要。迄今为止，已建立了 多种检测微囊藻毒素的方法．如生物毒性实验“：，HPLC检测法…，毛细管电泳法睁】， 碱性磷酸酶抑制性实验【61及酶联免疫抑制性实验071(竞争ELISA)。国内微囊藻毒素的 检测基本采用HPLC法．它既可定量也可定性．灵敏度高，是一种理想的用于实验室 精确分析少量样品检测方法。而要进行大量样品及野外水样的快速分析时，ELISA则 更为实用。微囊藻毒素的ELISA检测法在国外已发展得非常快，但仅有少数几个实验 室能制备毒索抗体，在国内则还未有报道。当前，国内许多研究和水质分析部门对快 速灵敏分析微囊藻毒素的测定方法的需求越来越迫切。 本文尝试用本实验室分离纯化的毒素LR，采用国外已建立的方法，制备微囊藻毒 素LR的多克隆抗体，并初步将其应用于微囊藻毒素的检测。 180 21世纪可持续发展之环境保护(下卷) 贰、实验设备和方法 1．微囊藻毒素的提取及制备 000 将采集的微囊藻水华于7 rtmin离心10min，沉淀用蒸馏水洗涤2～3次，40 ℃左右干燥。干藻粉以50 000rtmin． mL／g的比例加人5％的乙酸，搅拌抽提3h，然后在7 离心40min，收集上清，沉淀加入5％的乙酸继续抽提，如此重复两次后，全部上清用 于过真空纤维素柱(核工业部第八研究所)，以去除离心所不能沉淀的藻细胞。以上所得 的上清再过Sep．pak 离子水冲洗)，随后Sep．pak柱先用20％的甲醇洗～次，再用90％的甲醇洗脱下毒素。 将90％的甲醇洗脱液旋转蒸发干燥，此于粉即为粗微囊藻毒素。将粗毒素溶于20％甲 醇中，在制备型HPLC上将各个不同的微囊藻毒素峰分别收集，然后冷冻干燥。所制 备的纯毒索秤取少量溶于20％的甲醇中，过滤后在分析型HPLC(岛津公司)与标准 nm，流动相 毒素比较后．进行分析定量，HPLC的流速为1mLtmin，检测波长为238 是pH=3．0的磷酸盐缓冲渡和甲醇，两者以4：6的比例混合。 2．免疫原的制备 (1)EDA·BSA的制备 EDPC，溶解后加入 300BSA溶于15mL双蒸水中，在搅拌状态下加入400mg