海南菜豆上一种病毒的分子鉴定研究.pdfVIP

海南菜豆上一种病毒的分子鉴定 车海彦 罗大全 杨旭光 叶莎冰 (中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 571737) 摘要 从海南儋州和琼海采集的表现花叶症状的菜豆样品 通过粉虱传双生病毒的通用引物 PAPB进行PCR扩增检测 发现部分样品获得了与预期目标相同的一条约500bp的特异性 条带 并进行特异性条带进行了序列测定 初步推测部分感病叶片中含有双生病毒 关键词 菜豆 双生病毒 分子鉴定 海南岛由于其生态环境和气候条件的特殊性 海南的病毒种类和种群结构十分复杂 很 多种类均未见诸报道 笔者于近期大田调查的过程中 获得若干感病的菜豆叶片样品 通过 症状观察和初步的生物学实验 推测为双生病毒科病毒侵染后引起的病害 因此 本实验拟 通过分子手段鉴定该病毒可能的归属 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1供试材料 菜豆样品C1C2C3采自海南儋州地区 C4C5C6样品采自海南琼海 症状主要表 现为花叶 皱缩 叶背部叶脉突起 1.2方法 1.2.1 DNA提取及PCR扩增 采用CTAB法提取DNA根据双生病毒共同区及外壳蛋白基因的保守序列 参照周雪平 [] 等 设计的粉虱传双生病毒的通用引物对 PA(5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’) PB(5’-TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA-3’)(B C,T,GK G,TR A,GS C,GV A,C,G [1] W A,TY C,T)(由上海Sangon公司合成)进行PCR扩增 以健康的菜豆植株总DNA和无 菌双蒸水分别为阴性对照和空白对照 1.2.2.3琼脂糖电泳分析 取8 lPCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳 经溴化乙锭染色后 在凝胶成像系统上观察 Marker为Wide Range DNA Ladder Marker购自大连(TaKaRa工程有限公司) 1.2.4 PCR扩增产物纯化 克隆及序列测定 PCR扩增产物经纯化试剂盒 纯化后 与 pMD 18-T Vector(购自大连TaKaRa工程有限公司)在37水浴中连接1h然后转入制备好的 感受态细胞(Escherichiacoli DH5)中 在LB抗性培养基上 37培养1216h在4 放置 3 4h挑取白色菌落进行穿刺培养及摇菌 提取质粒 进行酶切鉴定 将样品送大连TaKaRa 公司进行序列测定 2结果与分析 2.1 PCR检测结果 以用CTAB法提取的6个菜豆的总DNA作为模板 用简并引物 PAPB进行PCR扩 增 结果如图 1 从儋州采集的C1C2样品中 琼海采集的C5样品总DNA中扩增到了约 500bp DNA片段(如图)所以初步确认上面3个样品中存在粉虱传双生病毒 1 2 3 4 M 5 6 7 8 1 空白对照 2阴性对照 C34 C55 C66 C17 C28 C39 2.2菜豆上双生病毒的测序结果分析 将C1C2C5样品的PCR产物克隆 测序后 其结果一致 推测侵染这3个样品的为 同一种双生病毒 获得的DNA片断大小为515bp进行网上BLAST分析 发现片断中283 332区段和475516区段范围内 相比较起其它的双生病毒 保守性比较强 由于我们进行 设计时 使用的是粉虱传双生病毒的保守序列 该片断应该包括双生病毒的AV2基因和AV1 基因的部分序列 分析这两个保守序列发现 283332区段位于AV2基因序列内部 而处 于AV1基因的起始密码子的附近 其实密码子位于288bp保守的475516序列位于AV1 基因的内部 处于AV2基因的终止密码子附近 这两个保守区的保守性高达90%以上 但是 这两段保守序列以外的其他序列 序列的变异是很大的 我们进行该病毒鉴定时使用了粉虱传双生病毒简并引物进行扩增 并对该病毒扩增获得 的病毒片断进行测序 可以初步确定C1C2C5样品中存在双生病毒 同时 我们可以看 到 获得的病毒片断通过编码区的BLAST分析显示 该病毒和已有的双生病毒科菜豆金黄花 叶病毒属的很多成员该序列的差异较大 因此 推测该病毒在进化关系上可能和其他的菜豆 金黄花叶病毒属的成员比较远 很可能是一种新的病毒种