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亲和素—生物素复合物 1、亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 2、亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 3、AB复合物多用于ABC法的免疫组化中 * LSAB（SP）法标记的链霉亲和素-生物素法 特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 1、 更快速：空间结构更小 2、更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 3、非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结 * 酶标亲和素 在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感 * 一步法（EPOS）及两步（Envision） 特点：以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点： 1、操作简便，省时 2、提高了敏感性和特异性 3、减少了背景着色 4、避免内源性生物素的干扰 * 多聚物载体 一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物 * 四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及其对策 * 免疫组化染色结果的判断 特异性着色具备特点 1、特定的定位：特定的组织、特定的细胞、特定的细胞内的部位 2、着色的不均一性：分布上的不均一、着色强度的不均一 3、颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐色 * CK染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色 * Kappa 胞浆着色 * TdT染色，胞核着色 * PR 胞核着色 * ER 胞核着色 * 免疫组化染色结果的判断 对照的设置 1、空白对照 2、阳性对照 3、吸收试验对照 4、替代对照 5、自身对照 * 异常着色（假阳性）原因及对策 异常着色原因：内源酶及内源性生物素、抗体本身原因、切片制作不当、冲洗不充分、DAB显色产生背景着色 假阴性的原因：抗原的丢失、抗原的遮蔽、抗体试剂因素、操作不当 * 非特异性着色原因及对策 内源酶及内源生物素 ↓ 1、灭活过氧化物酶-----3%H2O2 2、灭活内源性生物素----蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统 3、灭活碱性磷酸酶 * 异常着色原因及对策 抗原自身原因 ↓ 1、抗体不纯----应用单克隆抗体 2、标本中含有与靶抗原相似的抗原决定簇-----采用具更特异性抗原决定簇的单克隆抗体 * 异常着色原因及对策 切片制作不当 ↓ 1、 严重变性坏死及炎性病灶处 2、 切片裱贴不平 3、褶皱处 4、组织边缘部 * 异常着色原因及对策 1、清洗不充分→用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着色 2、DAB显色产生背景着色→未除去DAB的不溶性颗粒、DAB保存不妥，其氧化产物沉淀在组织上 * 非特异性背景着色原因及对策 电荷吸附→加二抗动物非免疫血清（牛血清也常用） * 假阴性的原因分析及对策 ㈠抗原的丢失 标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗原性破坏 ㈡抗原的遮蔽 1、福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽 2、修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理 * ㈢抗体的因素 1、有效性：一抗的特异性、效价、保存时间、保存条件及有无菌类污染 2、抗体间的相互匹配：二抗与一抗、三抗与二抗不匹配，三抗必须是一抗同种动物来源的同型抗体 * ㈣操作不当 1、掉片 2、消化了不该消化的靶抗原 3、切片放置不平抗体流失 4、遗漏重要的操作步骤（如漏加HRP的底物） 5、显色时间过短 解决方法：严格按照操作步骤进行 * 五、临床意义 ? 近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。 * 免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面： (1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； (2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位； (3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型； * (4)软组织肿瘤的治疗一