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蛇毒腺cDNA文库的筛选 小组成员：杨永艳、靳雪英、梁传雯、侯芝娟 背景知识 cDNA文库是用某一组织细胞中全部的mRNA反转录为cDNA构建而成的，有组织细胞特性及蛋白质基因表达的时空特异性。cDNA文库构建技术已经相当成熟，从cDNA文库中筛选目的基因是研究脏器基因表达谱的有效方法，另外，由于cDNA文库构建时用的原材料是细胞中成熟的mRNA，因此从文库中筛选出来的目的基因不含内含子，可以直接用于基因工程表达，是研究蛋白功能的好方法。 自20世纪70年代首例cDNA克隆技术问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的重要手段之一。通过构建cDNA文库不仅可以有利于濒危珍惜生物资源基因的保护，而且可以提供构建分子标记连锁图谱所用的探针，可以用于分离全长基因，进而开展基因功能的研究。因此，cDNA文库在研究特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，因而在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和凋亡调控、肿瘤分子机制等生命现象的研究中具有广泛的应用价值。 建立cDNA文库的目的在于分离目的基因，cDNA文库构建完成后，更繁重的任务是cDNA文库的筛选。目前cDNA文库的筛选方法主要有以下几种: （1）基于核酸探针的分子杂交筛选 主要用于已知蛋白部分氨基酸序列的目的基因筛选，是从cDNA文库中选择目的基因最常用、最可靠的方法。适于大规模筛选某蛋白的基因家族，但操作的技术难度相对较大，成本高。 （2）菌落杂交筛选法 可以通过在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上原位裂解细菌菌落, 再与相应的核酸探针进行杂交的方法进行筛选, 该法虽有一定的筛选特异性, 但操作中要用到同位素，通量小。 （3）基于抗体的免疫学筛选 该方法成功的关键是要提供特定的特异性抗体，并且该方法只能针对目的基因的cDNA按正确读框和方向插入载体的cDNA表达型文库的筛选。如果外源蛋白对宿主菌有毒性，则对应的克隆就无法正常生长，因此用抗体法筛选cDNA文库，前提必须是外源蛋白对宿主菌没有毒性。 （4）菌落PCR 通常先随机挑取大量候选菌落／克隆进行培养，取小体积菌液离心收菌体，绕过提取质粒DNA , 利用在PCR预变性过程中直接释放的质粒DNA作模板,以设计的特异性引物作PCR,然后用琼脂糖凝胶电泳结果中目的基因片段的大小及有无来初步获取候选克隆，再利用测序确定。 （5）随机测序 通常先随机挑取大量候选菌落／克隆进行培养（如几千个），提取质粒DNA , 然后直接以载体的通用测序引物进行测序,然后从中选取目的克隆用作下一步研究，该方法最大的缺点是成本昂贵。 (6) BLAST 　 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。 　　BLAST 采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。　　BLAST的功能 　　BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。 　　BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上发表的方法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对 序列也考虑在内了。BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。所查询的序列和调用的数据库则可 以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。 BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。 BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。 二、实验目的与原理 实验目的:从蝮蛇毒腺cDNA文库中筛选有较大外源片段插入的克隆作候选阳性克隆,为下一步研究奠定基础。（含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆） 实验原理:由于cDNA文库较大，一个个筛选工作量大，采用菌落PCR法可以同时对多个克隆进行初步鉴定，明确克隆体内是否有较大外源cDNA片段，然后可以对阳性克隆做进一步的筛选，提高筛选效率。故本次实验采菌落PCR法进行阳性克隆的筛选。 菌落PCR是以文库中随机挑取的菌落克隆为模板,采用