人microRNA-339慢病毒载体的构建及其对结肠癌细胞SW620迁移的影响.pdfVIP

·1574· UniversitatisMedicinalisAnhui2014 安徽医科大学学报Acta Nov；49(11) 人microRNA-339慢病毒载体的构建及其对 结肠癌细胞SW620迁移的影响 周畅1’2，陈芳2，陆艳霞2，袁理2，李学农2 摘要 目的 构建人microRNA一339(has．miR-339)慢病毒 载体，并探讨miR一339-5p／3p对结肠癌细胞SW620迁移能力 切后可产生两种不同序列的成熟剪接体：miR．339． 的影响。方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR- 339前体序列(pre．miR．339)及其侧翼序列，将pre—miR一339 报道。而增强两者在结直肠癌细胞中的稳定表达是 和PLVTHM载体经双酶切后连接，产生PLVTHM—pre—miR一 339慢病毒载体，并经测序鉴定；以PLVTHM-pre-miR-339、 毒载体成为理想的选择。为此，该研究将重组载体 psPAX2和pMD2．G三质粒包装系统共同转染293FT细胞， 包装产生慢病毒。流式细胞仪筛选建立稳定过表达pre— 式分选出稳定表达pre．miR一339的细胞，并初步探 miR一339的SW620细胞株，实时荧光定量RT-PCR检测miR一 339．5p及miR一339—3p表达。利用细胞划痕实验进行细胞迁 SW620迁移能力的影响；为后续进一步完成miR一 移能力检测。结果成功构建PLVTHM—pre—miR一339慢病毒 载体，测序证实所插入基因序列完全正确。倒置荧光显微镜 移的功能实验作准备。 下观察可见转染后的293F1细胞及SW620细胞均表达绿色 荧光。在过表达pre-miR-339的SW620亚细胞系中，miR一 1材料与方法 339-5p及miR一339—3p表达水平显著高于空载对照组。划痕 实验结果显示：与SW620／PLVTHM．NC组相比，SW620／ 1．1细胞株与质粒载体人结肠癌SW620细胞株 PLVTHM—pre—miR一339组细胞迁移减缓，划痕较宽。结论 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中 成功构建了PLVTHM．pre—miR-339慢病毒载体和稳定过表达 miR一339-5p及miR-339—3p的SW620亚细胞系，并证实miR一 339-50／3p可抑制结肠癌细胞SW620的迁移能力。 验室保存。 关键词 miR．339；结肠癌；慢病毒载体；细胞迁移 中图分类号R34 文献标志码A文章编号1000—1492(2014)11—1574—05 2000转染试 司；Opti．MEM培养基、Lipofectamine。M 剂及质粒中量抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司； 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有转 录后水平基因表达调控作用的非编码小分子RNA， 核酸内切酶MluI、ClaI及T4DNA连接酶均购自加 给结肠癌的研究带来了重大启示¨-21。miRNA可 在结肠癌发生、发展过程中充当癌基因或抑癌基因