固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化系统的建立及应用.pdfVIP

史堡邀生翅堂塑丝壅堂苤查垫!!生垒旦筮≥!鲞筮垒翅g塾也』丛迪堂丛墅墅坚丛：也堡垫!!：!塑：!!：塑!：垒 ·487· ．基础免疫学． 固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化 系统的建立及应用 李玉叶 梁兆端 吴思宇 谢炯 何军芳 吴敏昊 黄曦 张萍 【摘要】 目的构建固有免疫调控蛋白——双链RNA(dsRNA)调控的蛋白激酶(PKR)的串联 亲和纯化系统(TAP)，初步研究PKR蛋白功能，以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分 析。方法通过PcR扩增PKR目的基因，克隆至真核表达载体pcTAP-A中。将蘑组质粒pcTAP— PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默(PKR“)的HeIa细胞，并检测PKR对固有免疫信号通路之一， 即促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)激活的调控；最后利用串联亲和纯化试剂盒纯化分离与PKR相 HeLa 互作用的蛋白，验证PKR蛋白复合物的纯化情况。结果将蕈组质粒pcTAP-PKR转染PKRu 细胞后，24h后即可检测到PKR融合蛋白，相对分子质量约为75×103，其表达量随着转染时问的增加 而减少；PKR的过表达可发生自我磷酸化，并引起了MAPK信号通路的激活；westemblot结果显示， 小规模TAP纯化试验成功分离纯化了PKR蛋白。结论成功建立了一个PKR表达和串联亲和纯化 系统，并证明PKR具有调控MAPK信号通路活性，为今后鉴定与PKR相互作用的蛋白研究奠定了基 础。 【关键词】双链RNA；蛋白激酶PKR；亲和；纯化 EstaMishment锄da appH豫ti蚰oftandem娟nitypuri丘酬on町s咖ofi岫ate劬m砖regIIlatory PKRLl Fot西n Yurye，HANGzhm—dlmn，WUsi一，u．XlEJ洒ng，HE|Im?—垂lng，WUMi障一‰，HUANG Xt，zHANc P堍．De阻nmenl《f舰眦∞￡ogy，＆y协。删西TmP证越D诂e∞esco眦ml^|诋研《Ed叶 cm幻n．Z舶n鄹kn＆‰ZD厂胁d记妇．Sm，砬．s帆C，砌er5缸，，Qmn船砌Ⅱ5JOD80 nHn研：zHANG co帆spo，ld访g P魄。zh彻韶36@舢越．sysu，edu，c珏 of I Abst甩ct】ObjectiveToestal)lishatandem幽nitypurification(TAP)systeminnateimmune- proteinPKR趼d PKR thefuturescreenandidentificationofnovelPKR．in． re甜atory analvzefunction．for temction Methods was thenclonedintoamammalian proteins． PKR蜀eneamplifiedbyPCR，and expres． sionvector wastransfectedintoPKR pcTAP，A．ReconlbimntpcTAP。PKR knock．do帅(PKRkd)HeI且celIs the HeLaceHswerehanrestedfor by“pofec认MINE2000．跚dPKRoverexpressed mito蜀en．activ舢edprotein ofPKR were kinases(MAPK)activationanalvsis．Cellextracts overexpressedceUs puri6edusin只TAPkit 觚dex锄inedWestemblot．R鹳lIltsCalmodulin PKR by