下调miR-150表达抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖.docVIP

精品论文 参考文献 下调miR-150表达抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖 张先锋 肖娟 黄远见 　　(南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科 湖南 衡阳 421001） 　　【摘要】 目的：本研究探讨干扰miR-150表达对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。方法：使用脂质体将miR-150抑制剂转染5-8F，以无关序列抑制剂作为阴性对照。采用qRT-PCR技术验证miR-150 抑制剂转染细胞中miR-150的表达水平；通过MTS法实验观察miR-150表达下调对5-8F细胞增殖能力的影响。结果：转染miR-150 抑制剂的5-8F细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150 抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。转染miR-150 抑制剂的 5-8F细胞与对照细胞相比，增殖速度明显减慢，差异具有显著性（Plt;0.05）。结论：miR-150能促进鼻咽癌细胞增殖能力，它可能在鼻咽癌的发生和进展中发挥重要作用。 　　【关键词】 鼻咽癌；miR-150；细胞增殖 　　【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0172-02 　　miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码、内源性小RNA分子，通过靶向结合mRNA的3prime;非编码区，使翻译抑制或导致mRNA降解，进而调控靶基因表达量[1]。miRNA参与重要生物学进程的调控，包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程。肿瘤的发生发展过程涉及多种基因的参与和多种因子的调控。miRNA是重要的调控因子，通过调节相关癌基因或抑癌基因，从而参与多种肿瘤的发生、进展过程[2]。近期，本课题通过qRT-PCR技术检测了miR-150在鼻咽癌细胞系以及放疗抵抗中差异表达，通过转染miR-150抑制剂CNE-2R细胞的放射敏感性得到了提升，而转染miR-150模拟物后CNE-2细胞的抗辐射能力明显增强。本研究通过在鼻咽癌5-8F细胞中转染miR-150 抑制剂使miR-150表达下调，探讨miR-150下调对鼻咽癌细胞增殖的影响，从而初步揭示miR-150在鼻咽癌中生物学功能。 　　1.材料与方法 　　1.1 主要材料 　　miR-150 抑制剂及对照购自Ambion公司。 　　1.2 细胞培养　 　　鼻咽癌细胞株5-8F为典型低分化鳞癌细胞，培养于含10％小牛血清的RPMI1640，在95%湿度，5% CO2，37℃条件下。 　　1.3 细胞转染　 　　用胰蛋??酶对细胞进行消化，将细胞计数并接种在6孔板中，确保在转染当天，70％的细胞汇合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）将浓度均为100nM的miR-150 模拟物,miR-150抑制剂以及相应对照物转染至细胞。在转染36小时后，进行后续的实验。 　　1.4 qRT-PCR检测 　　取适量细胞，提取用试剂盒(OMEGA Bio-Tek)提取纯化miRNA，并利用miScript II RT Kit (QIAGEN)逆转录合成cDNA。 按照SYBR Green PCR试剂盒（QIAGEN）说明书进行Real-time PCR。研究miR-150含量时，选取RUN6作为内参。提取总RNA，实验独立重复三次。 　　1.5 MTS法检测细胞增殖活性 　　采用MTS法检测细胞增殖，根据CellTiter 96? AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega公司）说明书方法对细胞增殖进行检测。 　　2.结果 　　2.1 转染miRNA-21 抑制剂细胞内miRNA-21表达变化 　　分别用无关序列抑制剂及miR-150 抑制剂（终浓度为10mu;M/L、20mu;M/L、40mu;M/L）转染5-8F细胞，48小时后抽提细胞总RNA，运用qRT-PCR验证miR-150在细胞中的表达。结果表明，转染不同浓度miR-150抑制剂的细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150 抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。 　　2.2 miR-150下调后5-8F细胞增殖速度减慢 　　通过MTS法检测，绘制生长曲线来考察miR-150下调对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。结果发现，转染不同浓度miR-150 抑制剂的5-8F细胞从第48h起增殖速度明显减慢。统计分析各组在96h时的细胞增殖情况发现，不同浓度miR-150 inhibito组与对照细胞组相比，差异均有统计学意义（Plt;0.05），并且呈现明显的浓度依赖性。 　　3.讨论 　　MicroRNAs (miRNA