核酸酶P1的纯化和酶学性质研究.PDFVIP

第24卷第6期 南京工业大学学报 vol24№6 oF UNIVERSl-IYoFT日0HNOLOGY N0v2002 2002年u月 jOURNALNANJING 核酸酶P1的纯化和酶学性质研究 吕 浩，应汉杰 (南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京210009) 摘要：桔青霉发酵液通过硫酸铵分级沉淀、凝胶层析和离子交换纤维素层析等生化分离步骤．得到的核酸酶P1 比活力为711u／nlg，纯化倍数l500。纯化的酶蛋白纯品经晒聚丙烯酰胺电泳．呈现一条单带。谈醇催化反应 的最适pH范围为6～8，最适温度在70℃，在60℃以下时酶活较为稳定．锌离子对此酶有明显的激活作用，而 铜离子具有明显的抑制作用。 关键词：棱酸酶P1；纯化；酶学性质 中圈分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1671—7643(2002)06—0066—04 核酸酶Pl(NucleaseP1，Ec3．1．30．1)是一种美科学仪器有限公司)；电泳仪(北京六一电泳仪器 含锌的金属酶，核酸酶P1能够水解RNA和热变厂) 性DNA得到5’．核苷酸，广泛运用于核苷酸工业生1．2实验方法 产中，是具有重要应用价值的酶制荆。由于其独特 的作用机制，在基因工程研究领域也得到了相当的 法)”o；核酸检测使用定磷法【51；核酸酶Pl酶活测 重视[。“。 定使用紫外分光光度法L6J。 目前在我国有相当多的企业从事核苷酸生产。 核酸酶P1酶活测定方法(紫外分光光度法)： mL 但是由于产品质量问题。所生产的核苷酸产品大都 取甲乙两只试管，分别加入1 5％核酸液和O．8 被用于食品和饲料行业，与国外企业相比，利润较 n1L 5，0的0．2删／L醋酸缓冲液，于68℃水 pH 低。究其原因，除了技术装备的问题，缺乏对核酸 浴中预热10～15min，然后甲管加入0．2 mL酶液， 酶P1酶学性质的了解也是重要原因之一。 继续保温15“n。甲乙两管再分别加入高氯酸溶 本文在分离纯化桔青霉发酵产生的核酸酶Pl 液(2．5％)2lnL，乙管再补加0．2mL酶液，冷却放 的基础上，研究了此酶的相关酶学性质，目的是为 置15 500r／min，15 min，离心(3 min)，取上清液稀 酶解RNA生产57．核苷酸的生产工艺参数的改进释320倍，在260 提供一定的理论基础。 者为对照，在上述条件下，每分钟形成的核苷酸能 使260mn处的光密度差为1．0时的酶量，定义为 l材料与方法 一个酶活单位。计算公式如下： 1．1实验材料与设备 核酸酶P1的纯化：取50mL桔青霉发酵液，分 G 桔青霉发酵液由本实验室提供；Sephadex别通过硫酸铵分级沉淀【7j、凝胶层析【81和离子交换