添加β巯基乙醇对牛体外受精胚胎体外发育的影响研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 添加13．巯基乙醇对牛体外受精胚胎体外发育的影响 姜午旗n罗光彬1袁水桥1’2李东全1 (1．沈阳农业大学畜牧兽医学院动物胚胎工程实验室，辽宁沈阳110161：2．沈阳204医院生殖医学研究中心，辽 宁沈阳110034) 摘要：本试验研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时向其基础培养液中加入D-ME对胚胎桑椹 加入50，100 添加50 内细胞团细胞数分另4为76．6，8I．4、80．2；而添加100M的D-ME组时，桑椹胚率分别为51．5％、 M 明，体外发育培养液中添加50 D-ME可显著提高桑椹胚率、囊胚率、内细胞团细胞数(PO．05)， M 并且在4—8细胞期添加50D-ME最为合适。 关键词：D一巯基乙醇；牛；体外受精 目前，大多数胚胎体外培养采用的是5％C02+95％空气的气相系统，这样的体外培养条件与体内环 境相比，胚胎承受的氧压显著高于母体生殖道内环境。有证据显示高氧压会影响胚胎细胞的新陈代 谢，产生过剩的氧自由基(ROS)对胚胎的发育有毒害作用，进而降低细胞增殖，从而导致胚胎的发育 阻滞或延迟n’。目前研究表明有几种硫醇类化合物如半胱氨酸、谷光苷肽(GSH)等可以防止细胞的氧 化损伤，因而常常用于哺乳动物细胞培养。B一巯基乙醇(13一娅)是一种低分子量的硫醇类化合物， 研究证实在体外培养体系中添加B姐可以通过提高胞质内GSH浓度而给胚胎提供适宜的细胞内条 件，防止氧化损伤，有助于体外获得的6’8细胞胚胎发育到囊胚，并促进胚胎的晚期发育m’。为此， 本试验研究了B—脏在牛体外受精(IVF)胚胎的体外培养及胚胎的各个发育阶段中的作用，以期改善 和探讨可行的体外培养液，从而为牛体外生产(IVP)商品化奠定基础，同时为人类辅助生殖技术(试 管婴JL)中的人类胚胎体外培养提供参考依据。 1材料与方法 1．1材料 购于GIBCO公司，胎牛血清购于天津市正江高科技有限公司。 1．1．2卵巢的来源和保存：牛卵巢采自沈阳市于洪区金氏牛羊屠宰场，在牛宰后30min之内从其腹腔 内采集卵巢，保存在35C左右的装有灭菌生理盐水的保温瓶中，于2d,时内运回实验室。 1．2方法 课题资助：辽宁省科技计划项目资助(2003212) 课题名称：利用体外受精技术生产试管牛的关键技术研究 课题编号：1032051一I一02 联系人电话：024Email：ji垫g婴gi墼Y型：金盘：塑． 第一作者简介：姜午旗，女，1978年8月出生，硕士，助教。 161 中国畜牧普医学会动物繁殖学分会第十三矮学术研讨会论文集 _IIIIIII _I,,, 1．2．1卵母细胞体外成熟：用带有18G针头的10ml注射器从2～8mm的卵沲中抽取卵丘．卵母 遍，再厢成熟液清洗2遍，之后将10--15个卵母细胞放入有矿物油覆盖的成熟培养液的微滴40～ FSH+O．02IUlml 养液为TCM-199+10％FBS+10pg／mlLH+lp幽商13-Estradiol。 1．2．2精子获能处理：将细管冷冻精液解冻后检查其活力和密度，置于10ml离心管底部，用含10mM 15min备用。精子活能液为BO液十5mM咖啡因+3mg／mlBSA+l叫幽Ill肝素。 湿度。 1．2．4受精卵体外培养：将IVF后的卵母细胞从受精液中取出，用自拉的吸胚管反复吹打卵母细胞使 其周围颗粒细胞脱落，然后用体外培养液清洗3,-一5遍，移入培养液滴中与单层颗粒细胞共培养，培 养条件同体外成熟。受精卵体外培养的基础培养液为TCM．199+10％FBS。 1．2，5囊胚ICM和滋养层细胞染色 (1)将胚胎放在碘化丙啶染色液(100p．g／ml，用无FBS的PBS配置)中染色10rnin (2)移,K至lJHochest33258(25pg／ml，用无水乙醇配置)中，4C过夜 (3)第二天将胚胎转入含50％甘油小液滴的载玻片上，加盖盖玻片 (4)荧光显微镜下观察，呈现蓝色荧光的为ICM，粉红色的为滋养层细胞 1．2．6试验设计 试验1 以确定