植物转化及转基因的检测.pptVIP

福建省农业遗传工程重点实验室 室 福建省农业遗传工程重点 基因工程的概念 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程. 基因工程的主要步骤 基因分离 ※经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 DNA重组 ※将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标 记的载体分子上，形成重组DNA分子。 转化 ※将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并增殖。 筛选 ※从细胞繁殖群体中，筛选出重组子。 鉴定 ※从重组子中，提取DNA，进一步分析鉴定转化子。 表达载体构建 ※将目的基因克隆到表达载体上，使之在新的遗传背景下实现功能表达。 植物基因工程的主要步骤 植物遗传转化 ※ 用生物或物理方法将目的基因转入植物受体中 转基因植物的鉴定 ※ 分子水平、个体水平、群体水平检测目的基因的遗传、表达及其稳定性 转基因作物的育种利用 ※ 对转基因目的性状和农艺性状的综合评价 转基因作物的安全性评价 ※ 食品安全性、生态安全性评价和转基因作物安全利用 转基因作物的示范推广和应用 植物的遗传转化方法 农杆菌介导法 基因枪法 电穿孔法 PEP法 脂质体法 花粉管通道法 几种常用植物基因转化方法的比较 水稻（籼稻）根农杆菌转化技术方法 Monocotyledones are not easy to handle – callus is very difficult to be initiated, and A.tumefaciens is not pathogenic for them DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles. 高压气体基因枪－PDS-1000/He 转基因植物的检测 分子检测确定转基因的整合和表达 DNA水平检测 PCR、 Southern杂交 RNA水平检测 RT-PCR检测、Northern杂交 蛋白水平的检测 Western杂交、ELISA检测、酶活性测定 DNA 水平的检验方法 PCR(polymerase chain reaction)：首选的检验方法 多重PCR 定量PCR Southern Southern blot: 经典可靠的检测方法 生物芯片(microarray) : 仍在研发阶段 即時定量 PCR (real-time PCR) 1 × TaqManTM Universal PCR master mix buffer 1 × TaqMan buffer A， 5 mM MgCl2， 8% glycerol， 200 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP)， 400 mM dUTP， 0.125 units Amperaes? uraxil-N-glycosylase (UNG) 0.3 units AmpliTaq Gold? DNA polymerase 200 nM passive reference dye ROX (6-carboxyrhodamine) 核酸分子杂交的基本原理 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列.通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 DNA ↓ 电泳分离核酸片段 ↓ 转移至固相支持物（印迹技术） ↓ 杂交 ↓