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生物信息学概论 简论PCR的引物设计 摘要：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 正文： 引物的长度 引物长度：寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。 二． 引物GC含量和Tm值 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。PCR引物应该保持合理的GC含量。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。三。引物的额外序列与退火温度 若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。 在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。 四．引物的3’末端核苷酸组成 引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。 引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。 在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。 引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的