ff22免疫学检测技术的基本原理PPT.ppt

第二十二章 免疫学检测技术的基本原理;主 要 内 容; 免疫学检测技术： 运用免疫学原理设计的检测方法 可用于： 诊断免疫相关性疾病 探讨发病机制 监测病情和治疗效果;第一节 抗原或抗体的检测;一、抗原抗体反应的原理：;影响抗原抗体反应的主要因素：;抗原与抗体的种类：;二、抗原或抗体的检测方法;1、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象 ： （1）玻片法—定性试验：已知 Ab ? 未知 Ag(?) ABO血型鉴定， 细菌种属抗原型别的鉴定; （2）试管法—半定量试验： 诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”;2、间接凝集反应：;（二）沉淀反应 (precipitation) ： 可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀线）。;含抗人IgG琼脂 制成平板;2、双向免疫扩散(double immunodiffusion)： ----定性检测Ag或Ab ； Ab效价滴定;;３、免疫电泳 （immuno electrophoresis);;4、火箭电泳：单扩试验 + 电泳 可定量分析;5、免疫比浊：;（四）免疫标记技术 －用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应：;1、免疫荧光技术 （immunofluorescence techniques）;;间接免疫荧光检测自身抗核抗体;用酶标记Ab(或Ag)与标本中的Ag(或Ab)发生特异性结合 加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质 根据颜色可作出判断或测量光密度值;（1）双抗体夹心法：;（2）间接法;;3、放射免疫测定（radio immunoassay，RIA）：;4.免疫胶体金标记技术(immunologic colloidal gold signature，ICS) ;常用方法：胶体金斑点渗滤试验 胶体金斑点免疫层析试验;第二节 免疫细胞测定;一、免疫细胞的分离： （一）外周血单个核细 胞（PBMC）的分离： 方法：密度梯度离心法 分离液：聚蔗糖泛影葡 胺 （比重：1.077 ±0.001）;（二）T、B细胞的纯化： 贴壁法——去除单核细胞 花环沉降法、尼龙毛法——分离T、B细胞 （三）免疫磁珠分离法： （四）FACS分离法：;二、T细胞数量检测： 1、E花环试验： 原理：T细胞均有CD2分子，而B细胞无; 将SRBC与人外周血淋巴细胞混合; SRBC可结合于T细胞周围形成花环细胞。;2、免疫荧光标记技术： 用荧光素标记CD3、CD4或CD8单抗与淋巴细胞混合 经荧光显微镜观察 或用流式细胞仪测定;;;三、NK 细胞杀伤功能检测：;四、白细胞功能测定;形态学特征: 体积增大4---5倍; 核染色体疏松; 核 仁明显; 胞浆出现空泡。;（１） 3H-TdR 细胞周期 外周血中T细胞通常处于细胞周期的G0期， 受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0期进入G1期，并合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础， 然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加3H标记的DNA前体(3H-胸腺嘧啶核苷，3H-TdR)，后者即掺入新合成的DNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度。;　　将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实 验管加适量PHA后，空白对照不加PHA，置5％CO2温箱37℃培养56h，加适量3H-TdR，继续培养16h，收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpm)，刺激指数(SI)表示转化能力。 SI＝PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值 SI ＞2; （2）MTT法 单个核细胞与PHA混合培养70h后，加入四甲基偶氮唑盐（MTT）后再培养4~6h， MTT在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成蓝黑色的MTT-甲，形成MTT-甲的量与细胞增殖程度正相关，测OD值： SI=试验孔OD值/对照孔OD值;２、细胞毒试验 　　CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，依据待检细胞的性质，选用相应靶细胞，根据靶细胞破坏程度，鉴定相应细胞的功能。;3. 细胞因子的检测;　细胞因子检测可了