实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位.pptVIP

* * 实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位 一、实验目的 1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤。 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。 二、实验原理 酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化， 如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶活力被显示。 反应如下： β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3- PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色) 通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。 三、实验材料、试剂和仪器 1.材料 小白鼠 2.试剂 1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙 10ml,蒸馏水80毫升。 2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L 乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地 滴加3% β -甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产 生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存) 。 3)2％硫化铵溶液：硫酸铵2毫升＋98毫升水。 4)0.05mol／L乙酸缓冲液。 四、实验方法与步骤 １.前处理 　（１）小白鼠每日腹腔注射６％淀粉肉汤１ml，连续注射３天． 　（２）在第３－４天,再向腹腔注射１ml生理盐水，过３～５min用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，把内脏推向一侧，用不带针头的注射器或吸管吸取腹腔液． ２.制片 　 1.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开，自然干燥。 　 2.放入作用液中，37℃ 保温30min 。 　 3.蒸馏水漂洗片刻。 　 4.放入甲醛钙固定液中固定5min 。 　 5.蒸馏水漂洗片刻。 　 6.放入2%硫化铵液3-5min 。 　 7.蒸馏水漂洗,镜检。 3.对照实验: 　　　标本放入作用液前先用高温（50℃）处理30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上3-7步。 五、实验中的注意事项 1.铅离子的浓度，作用时间 作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象． 2.腹腔注射 1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.5～7号针头。2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔。 3.小鼠的处死 脊柱脱臼法 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，瞬间死亡 。 皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液 不流入腹腔。 腹腔内的冲洗液要全部吸干。 六、实验结果与分析 巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。 *