羊与麝朊蛋白基因的序列差异研究.pdfVIP

兽医部分 羊与麝朊蛋白基因的序列差异+ 陈豪泰“ 张杰1刘永生1吴润2 (1．中国农业科学院兰州兽医研完所謇畜疲痛病原生物学国家重，最实验室 农业部畜禽病毒学重点实验室甘肃兰州730046； 2．甘肃农业太学动物医学院甘肃兰州730070) 摘要：分别从庸与羊垒血中提取基因组总DNA，用所设计引物烈聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(hPc)基因， 井克隆到pMDl8一T栽体。序列分析表明所克隆的Pr一基因的片段大小为771bp，包台了朊蛋白基因的完整编码压序列， 为舍单一外显子的完整开放阅读框。PrPc基因序列相比较，其核苷酸和氨基酸同源性分刺在粥，0％和98．2％。在整个 碱基替换中，多数替换是保守的，为同艾突变，位有5个替换引起氨基酸突变。 关键词：藏绵羊；麝；朊蛋白基因；序列差异。 动物和人的传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform protein， PrP)有关，PrP及其基因成为海绵状脑病研究的焦点“’21。PrP的发现引起分子生物学和医学研究领域的 isoform isoform 胞型朊蛋白(cellular ofprionprotein，PrPc)和痒病型朊蛋白(scrupleof面“protein，PrP”)，二者 有相同的氨基酸序列和分子质量，但在三维结构和生化特性上显著不同”。41。截止目前，英国已报道有20 多万头牛染上疯牛病，其原因被认为是由于牛饲料中添加了污染羊痒病因子的肉骨粉，使羊痒病因子传 染给牛”4】，并且己诊断有12个人因食用病牛肉受到传染而发病”]，尤其最近美国发生的鹿科动物的慢性 消耗性病(ChronicDisease，CWD)，这似乎给已经形成疯牛病蔓延的欧美社会和经济雪上加霜”J， w船tins 因为这些病的病因和病理是相似的，这在欧洲引起了极大的震惊和恐慌”1。 哺乳动物和鸟类nP的氨基酸序列具有高度同源性，且各种结构元件是保守的“J。绵羊朊蛋白是常 染色体基因编码的256个氨基酸的糖蛋白，翻译后经修饰截去N一端和C一端的信号肽，产生具有复合型 硫键。哺乳动物PrPC的分子质量为33—35kLl。 麝类动物是小型偶蹄类动物，包括林麝(Moschus 右。近年来，由于栖息地的破坏及过度猎捕和贸易，加之疾病和自然灾害造成的死亡，使麝的资源量下降 近90％，已无法承受目前的消耗强度，物种资源状况十分危机。2002年麝被我国提升为一级保护动物，这 也说明麝的濒危程度越来越严重。因此，研究麝类动物各类疾病及其致病机理，这对防制麝类动物疾病 发生和保护濒危物种均具有重要的现实意义。 我国是个畜牧业大国，动物群体数量大，而且每年都进出口种畜及其他产品。虽然TSEs的检疫已提 上日程，但TSE的发生也不是没有可能，再加上国外的检测试剂盒非常昂贵，应该对PrP及其诊断方法进 行初步研究。考虑到羊痒病发生和疯牛病发生之间的密切关系，我们试图通过PrPc基因的克隆，以了解 ·农业部畜禽病毒学重点实验室资助项目(2∞2—01)。 496 o2006学术年会 我国特有动物品种的PrP基因背景，使有限的国际基因数据库得到补充，为进一步研制PIP多克隆抗体和 单克隆抗体以及研究PrP构象变异机制提供实验材料和建立技术平台。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1血样无菌采取自然死亡安徽麝和健康新疆细毛羊的血液，分别以抗凝剂(100mL溶液中含o．48 g柠檬酸，1．32g柠檬酸三钠，1．47g葡萄糖)抗凝，抗凝剂与血体积比为1：5。安徽麝血样的编号粥，新 疆细毛羊血样的编号MY。 18一TVector， 1．1．2试剂基因组DNA提取试剂盒，EXTaqTMDNA聚合酶，DNA凝胶回收试剂盒，pMD E．coli JMl09感受态细胞，质粒纯化试剂盒，限制性内切酶EcoRI、HindIll，D