PCR微孔板液相杂交检测深部致病真菌实验性研究.pdfVIP

指导小组成员 李红宾 副教授 黄云莉 主管技师 董天样 主治医师 昆明医学院硕士研究生论文 PCR-微孔板液相杂交检测深部致病真菌 实验性研究 摘 要 目的 探索建立一种快速、敏感、特异检测深部真菌方法。 方法 以5，端标记有生物素来源于真菌28SrDNA保守序列的真菌通用引物对三属九 种真菌进行PCR扩增后，分别进行琼脂糖电泳和与5’端标记有地高辛的真菌通用探针 或种特异性探针在PCR仪上900C2分钟，550C1分钟进行液相杂交，并将杂交产物固 定于链亲和素包埋的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结合，底物显色。 结果 1.真菌通用引物可广谱地扩增九种真菌，扩增片段为260bp，与文献报告一致。 2.真菌通用探针可有效地检测九种真菌PCR扩增产物.3.真菌PCR产物经微孔板液 相杂交法检测较琼脂糖电泳敏感32倍，分别为32fg,lfga4.白色念珠菌种特异探针、 新生隐球菌种特异探针、烟曲霉种特异探针在微孔板液相杂交过程中表现高度的特异 性.5.微孔板液相杂交可同时检测多种深部真菌。6.微孔板液相杂交重复性良好。 结论 微孔板液相杂交可快速、简便、敏感、特异地检测深部真菌，可成为临床早期 诊断深部真菌感染有效方法之一。 关键词 深部真菌 PCR 微孔板液相杂交 昆明医学院硕士研究生论文 Apilotreserachonthedetectionofdeep-fungiby liquidphasehybridizations forPCR-ELISA abstract ObjectiveToestablisharapid,sensitiveandspecificmethodtodetectandidentify deep-fungibyaliquidphasehybridizationsforPCR-ELISA. MethodsAccordingtothehigh-conservedsequenceoffungal28SrDNAgene,weusedan universalprimersforfungalkingdomlabeledwithbiotionat5’end.AfterthePCR,the productmixedwithuniversalprobeorspecies-specificprobelabeledwithdigoxinat5 -end,hybridizationwascarriedoutinathermocyclerfor2minat900Candlminat55C.The mixturewascapturedonmicroplatewellscoatedwithstreptavidinandwasdetectedwitha peroxiase-labeledantibodyandsubstrate. Results 1.All9strainsfungicanbeamplifiedbytheuniversalprimerpair,theproducts wereabout260bp,whichconsistwithotherpastreports.2.Theuniversalprobecandetectall 9fungiPCRproductinourPCR-ELISA.3.OurPCR-ELISAcandetectaslittleas1fg fungalDNA,whichis32timesmoresensitivethanagrosegelelectrophoresis.4.Candida albican-specificprobe,