麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与体外培养.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与体外培养 赵雪萍1王锋住王子玉’孙永成1丁玉华2 (1．南京农业大学动物胚胎工程技术中心江苏南京210095： 2．江苏大丰麋鹿国家级自然保护区，江苏大丰224136) 摘要：对麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征和冷冻保护剂、冷冻程序筛选等 进行了研究。通过组织块培养法获得麋鹿皮肤成纤维细胞，用胰酶轻度消化后，经3—4次传代可得 的DMEM培养基最适宜细胞生长；10％DMSO作冷冻保护剂，冷冻时先在4℃放置30min，移入一20℃ 放置1．5h，再在液氮面上方悬吊7—8h后投入液氮，复苏后可获得87．78％的贴壁率。 关键词：麋鹿；皮肤成纤维细胞；体外培养；冷冻保存 麇鹿是我国一级野生保护动物，与大熊猫一样，素有“活化石”之称，具有重要的研究价值。 但由于历史变迁与生活环境的破坏，以及自身繁殖速度较慢，致使现有的麇鹿数量非常有限，异种 核移植技术的深入研究为保护濒危珍稀动物提供了新的思路和研究方向u～。对于异种核移植而言， 如何简便、高效地获得丰富的供体细胞是该技术关键的上游步骤之一。动物的皮肤是理想的核供体 细胞源，它不仅可以提供完整的遗传物质，而且在取材后对动物的健康几乎没有影响晦1。目前，体 细胞培养技术虽然已较为成熟，但不同动物、不同组织细胞的体外生长、增殖规律有一定的特异性。 本试验研究了麇鹿耳皮肤成纤维细胞的分离及原代、传代培养方法，观察其在体外的生长特征，并 分析了血清浓度对细胞生长速度的影响，比较不同冷冻液和冷冻方法的效果。 1材料与方法 1．1试验动物与试剂 1．1．1试验动物 江苏大丰麇鹿国家级自然保护区成年麇鹿(6，6-7岁)。 1．1．2主要试剂 化学试剂公司)，丙酮酸钠、胰蛋白酶、DMSO均为Sigma产品。 1．2试验方法 1．2．1原代培养 对麇鹿进行飞管麻醉，刮毛后用灭菌耳号钳打下两块皮块，用1％新洁尔灭冲洗后迅速投入无 血清的、添加10001U／mL青霉素与链霉，剪成约1mm3大小的碎块，PBS洗涤后均匀铺瓶，放入培养 箱，4h后加入培养液，培养液成分为高糖DMEM，添加IO％NCS，5mMHepes、100Iu／mL青链霉素。 每3d换液一次。培养条件为37．5C、5％C0。、饱和湿度哺1。 1．2．2成纤维细胞传代及纯化 细胞长成致密单层后，用0．25％胰酶消化，待大部分细胞变圆时，加培养液终止消化，并反复 吹打。因为成纤维细胞消化脱壁比上皮细胞快，在前三代传代酶消化后，待细胞刚变圆即终止消化， 只收集脱壁细胞，这样便可得到纯化的成纤维细胞。 【基金项NI江苏省自然科学基金项目资助(BK2003075) 【作者简介】：赵雪萍(1980．10一)，女，硕士，主要从事哺乳动物胚胎工程研究工作 2【通讯作者】：王锋(1963．8--)，博士，教授，博导，主要从事动物胚胎工程研究。Email：fwan9200l@sina．com 445 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 1．2．3贴壁细胞形态学观察 X 将细胞悬液以1 104／mE接种于放有盖玻片的6孔板，待细胞铺满盖玻片的40％～60％时，取 出盖玻片，采用HE染色法Ⅲ染色，在显微镜下直接观察拍照。 1．2．4生长曲线的测定 取第四代处于对数生长期的细胞，按2×104个／mE的密度接种于24孔培养板，每孔接种lnlL。 从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，算出平均值，共记7d。以培养时间(d)为 横坐标，细胞密度为纵坐标作生长曲线。 1．2．5分裂指数 将洁净灭菌盖玻片置培养板中，每孔接种1×105个细胞，每天取一张盖片，冰醋酸、甲醇固定， Giemsa染色，分级乙醇脱水，加拿大树胶封片，光镜下计数每千个细胞中处于分裂相细胞的比率。 以分裂指数随时间的变化绘制分裂指数曲线。 1．2．6细胞染色体分析 1．2．6．1分裂中期细胞染色体地制备 u 当细胞长至80％～90％汇合时，加入秋水仙素，使其最终浓度为O．4g／mL培养液，继续培养 5～6h，到培养结束时，倾弃培养液。加入适量2．59／L胰蛋