鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株适应鸭胚成纤维细胞的研究.pdfVIP

家禽传染病 鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株适应鸭胚成纤维细胞的研究 郭宇飞，程安春，汪铭书，贾仁勇，文明 (动物疲病与人类健康四川省重点实验室，四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，四川 雅安 625014) h 研究。10日龄鸭胚经胰酶消化和机械分散后，其成纤维细胞在舍lO％小牛血清的MEM营养液中生长36 左右后成为致密的细胞单层。DEV-CHv人工感染成年健康鸭后，取病死鸭肝脏组织接种绒毛尿囊腔经10 连续传代6次适应了在DEF上生长以后，细胞病变以成纤维细胞的脱落和形成圆形蚀斑为主要病变特征。 h左右出现细胞脱落，36 DEV-CHv接种DEF后通常30 h左右在细胞单层上形成明显的蚀斑。 关键词：鸭病毒性肠炎；鸭胚成纤维细胞；蚀斑 1．材料方法 分别进行了流行病学、临诊症状、病理剖检、血清中和实验、攻毒保护实验、分子生物学检测等研究工作， 并根据上述研究的结果综合确诊为鸭病毒性肠炎病毒，且根据分离地和毒力特征将其病原命名为鸭病毒性 肠炎病毒CH强毒株；DEV-CHv以存在于病死鸭大脑组织中的形式于一70℃低温保存。 1．2麻鸭：来自于DEV-CHv分离地鸭场，为经过检疫的成年麻鸭，健康条件良好。用于人工感染复 壮DEV-CHv实验。 1．3鸭胚：为孵化至10日龄时的麻鸭胚，购自于未发现鸭病流行和未免疫过DVE疫苗的雅安偏远山 区。用于接种DEV-CHv和制备鸭胚成纤维细胞。 1．5 条件下研磨成乳悬液；以lml，只的剂量经腿部肌肉接种于健康麻鸭；攻毒鸭隔离封闭饲养于清洁的环境中， 供以充足的饲料和饮水并密切观察。 洗蛋壳表面，将蛋壳表面的新沽尔灭完全冲洗干净并将蛋壳表面晾干后先后分别用5％碘酒和75％酒精消 mm 毒蛋壳表面：无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿、内脏并将胚体剪成l 大小的小块，之后置于加有玻璃小珠的三角瓶内，加PBS适量，加细胞分散剂150gl／胚，于37C水浴中 消化3rain；立即将细胞悬液以4000r／rain离心5min．倾弃上清，细胞沉淀悬浮于适量MEM后用5层纱 ml／瓶，水平静置于37C 布过滤，滤液加10％d、牛血清和100IU／ml双抗后分装于100ml细胞培养瓶中，7 细胞培养箱中进行培养。 1．7DEV-CHv适应在DEF上生长的方法： 1． 攻毒鸭死亡后立即对其进行病理剖检并在无菌条件下取肝脏组织，剪碎 后加PBS按1：10比例匀浆成悬液。 2． 将该组织悬液于4C以10，000r／rain离心30min，上清经孔径0．22岬的 滤膜过滤。 3． 取过滤后的肝脏组织上清，接种到刚刚长成致密单层的DEF上，并注意 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 观察DEF的细胞病变。 3．1如细胞不出现病变则收获细胞，盲传5代。 4． 取过滤后的肝脏组织上清，以0．2ml／胚剂量接种到lO日龄鸭胚的绒毛尿 囊腔中，取病毒致死鸭胚尿囊液接种到刚刚长成致密单层的DEF上(接毒24h后 死亡且尿囊液清凉的鸭胚认为是病毒致死鸭胚)。 4．1如细胞未出现病变则将尿囊液在鸭胚中进行传代，重复步骤4。 4．2如细胞未出现病变则同时收获每一代尿囊液接种细胞后的细胞毒，在细 胞上盲传5代。 5．上述DEV-CHv接种于DEF和鸭胚时．均取相应的未接毒DEF和鸭胚作 为对照。 2．实验结果 2．1DEV的人工感染鸭实验：实验鸦在接种病毒后出现了体温升高、两腿麻痹