黇鹿和麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养.pdfVIP

556囝2004学术年会 站鹿和糜鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养4 潘晓燕1，王锋”+，王启凤1，丁玉华2，王正朝1 1．南京农业大学动物胚胎工程技术中o，江苏南京10095； 2．江苏省大丰麋鹿国家级自然保护区受理处江苏大丰224136 摘要：为了获得丰富的核移植供核体细胞，本研究通过活体采集鹿及麋鹿耳皮肤组织，利用 0．1％胶原酶消化后组织块法和直接组织块法进行原代培养，再用酶消化法和反复贴壁法进行传代培 养，纯化了成纤维细胞，并进行了冷冻保存试验。建立了简易的鹿和麋鹿耳皮肤成纤维细胞的体 外培养程序。 关键词：鹿；麋鹿；成纤维细胞；体外培养 国一级野生保护动物，具有较高的医用价值、经济价值和观赏价值…。但由于历史变迁与生活 环境的破坏，以及自身繁殖速度较慢，致使现有的麋鹿数量非常有限。以Dolly羊为标志的体 细胞核移植技术”1，相继在牛、小鼠、山羊和猪等哺乳动物中获得成功。核移植技术的深入研 究为保护濒危珍贵动物提供了新的思路和研究方向。1999年，陈大元等首次将大熊猫体细胞 核移入去核的兔卵母细胞中，得到了世界上第一批异种克隆大熊猫胚胎”】，这一研究成果带动 了异种核移植研究的深入开展。2001年，Meirelles等”1将瘤牛(Bosindicus)的早期卵裂球移 植到去核的黄牛(Bos taurus)卵母细胞内获得了第一只通过种间胚胎细胞核移植方式出生的 动物。要进行体细胞核移植技术的研究，建立一套简单易行的从动物活体组织采样、原代及传 代培养、冷冻保存的动物体细胞系的模式是必不可少的。由于麇鹿皮肤组织采样比较困难，本 研究先以与麇鹿同属于真鹿亚科、且核型相近的站鹿耳皮肤组织为研究对象，对皮肤成纤维细 胞进行分离培养、纯化与冷冻保存。在此基础上，随后又开展了麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离 培养及冷冻保存试验，旨在建立一种简单、高效的供体皮肤成纤维细胞的体外培养模式，为麇 鹿的异种克隆提供核供体。 1材料与方法 1．1试验材料 皮肤组织分别采自于南京市红山动物园的1头成年雄性站鹿与江苏省大丰麋鹿国家级自然保护 区的1头雌性麋鹿。 1．2主要试剂 +基金项目：江苏省自然科学基金(BK2003075) autof：王锋(1963一)，博士，教授，从事动物胚胎工程研究，E-maihcom ”通讯作者Corresponding f_wan92001@sina 作者简介：潘晓燕(1979～)，女，山东烟台人，博士研究生。 2004学术年会 四季青，。 1．3试验方法 1．3．1采样及消毒处理 用75％乙醇或1％新洁尔灭反复擦洗少血管处的皮肤，刮毛，碘酒消毒，75％乙醇脱碘，用无 4℃带回实验室。 在无菌操作台上，进行如下消毒处理：①75％乙醇浸泡30s；②l‰新洁尔灭浸泡5rain；③双抗 除去血污、软骨及残余新浩尔灭。 1．3．2原代培养 将皮肤组织剪成约lmm3的小块，PBS洗涤(自然沉降)2次，然后进行培养。 ①直接组织块培养 将组织块接种到培养瓶(50m1)底部，每瓶置约15块，均匀铺开，翻瓶，加5mlDMEM(10 度、5％C02。 ②O．1％胶原酶I消化后组织块培养 皮肤组织块先用0．1％胶原酶I NCS)终止消化，轻轻吹打数次，进行组织块培养，方法同上。 1．3．3培养细胞的传代及纯化 加热板上消化2--3rain。显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，弃酶液，从培养瓶侧壁加入少量培 养液，中和酶液，并弃去，再hu．,k 5～10ml培养液，反复吹打，以1：2的比例进行分瓶培养。培 养3～4代后便可得到纯化的成纤维细胞。 1．3．4冷冻保存 标记好冷冻细胞的种类、代数、密度、冷冻液种类、冷冻时间等。将冻存管放入泡沫盒中，置4℃ 冰箱2h，转入一28℃冰箱过夜，次日投入液氮(一196(2)中长期保存。 1-3．5复苏和培算 将冻存管从液氮中取出，在空气中停留片刻，迅速投入37。C水浴中，来回晃动使其迅速融化。 弃上清，加入培养液重悬细胞，调整细胞密度。将细胞接种到培养瓶中，在37。C，5％C02，饱和湿 度条件下培养，并观察接种24h的贴壁率