评定小鼠囊胚质量双重荧光染色法的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 ■舅鲁量皇曼量量舅舅舅皇皇皇舅舅曼皇量曼量舅舅舅舅曼曼曼曼曼量罾曼曼皇曼曼 II,量皇鼍皇皇童舅鼻量蔓曼薯薯童 评定小鼠囊胚质量双重荧光染色法的研究 孟令君高建明’刘云海刘烈琴薛君忠张建芳 ， (北京农学院动物科学技术系，北京102206) 摘 要： 研究并建立适合小鼠囊胚的双重荧光染色方法。用建立的双重荧光染色法对小鼠的囊 胚细胞计数，分别计数囊胚不同时期的内细胞团和滋养层的细胞数，比较不同发育时期囊胚的内细 胞团扣滋养层细胞的比例，评定囊胚的质量． 关键词：双重荧光染色；小鼠囊胚；内细胞团；滋养层；细胞计数 ’ 随着胚胎生物技术工作的不断拓展和深入，无论是体外生产胚胎、胚胎的显微操作还是胚胎移 植，在追求胚胎数量的同时，胚胎的质量也越来越引起人们的关注。胚胎细胞计数方法是评定胚胎 质量的一种常用方法。常用的胚胎细胞计数方法有空气晾干法、压片法、放射性元素标记法和荧光 染色法四种ll】以及双重荧光染色法。双重荧光染色法加入了直接作用于滋养层的抗体，用两种能发 Cell 出不同荧光的染料来分别染色内细胞团(Inner 于评定囊胚质量更为科学。双重荧光染色方法早已用于观察肿瘤【2】、癌细胞【3】、凋亡细胞[44、精子 t6]等的形态变化，而用于通过计数哺乳动物胚胎细胞数量评定其质量还尚不广泛。随着对双重荧光 染色方法简便、准确的优点的了解，用此方法评定胚胎质量得到了很大的重视。本试验通过筛选可 以有效作用于小鼠囊胚滋养层的抗羊脾细胞抗血清的稀释度和作用时间，以及豚鼠补体的稀释度和 染料染色时间，建立针对于小鼠囊胚的双重荧光染色方法，分别计数ICM和TE的细胞数，评定小 鼠囊胚的质量。从而可为进一步比较体内外胚胎质量差异和深入探讨细胞连接和细胞之间的信号对 胚胎发育的作用提供可靠手段。 1材料与方法 1．1实验动物 自由采食，自由光照，经l周适应性饲养后，方可进行超排处理。 1．2实验药品 孕马血清促性腺激素(PMsG，天津试验动物中心)、人绒毛膜促性腺激素(hCG，宁波市激素 Iodide，PI，P4170， sigma) 1．3囊胚的获取 96h后处死小鼠，用含I％FBS的PBS冲卵液从子宫冲出 (hCG)15IU／只，进行超数排卵。注射hCG 囊胚。 1。4双重荧光染色 1．4．1抗血清的稀释度和作用时间筛选 去透明带后的囊胚移入到分别加入1：5、1：10、1：20、l：40抗羊脾细胞抗血清的培养小滴 中孵育一定时间，能破坏滋养层细胞，使外层滋养层细胞着色为红色即为最佳稀释度。然后进一步 基金项目：北京市教委重点项目 作者简介：孟令君，女，24岁，北京农学院硕士研究生 水通讯作者 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 全发生作用的最佳时间。 1．4．2豚鼠补体的稀释度和染色时间筛选 把囊胚移入到豚鼠补体稀释度分别为l：5或l：10的培养小滴中孵育，滋养层细胞在免疫介导 间。 1．4．3双重荧光染色方法步骤 中孵育。然后把抗原处理后的胚胎移出培养小滴清洗。首次清洗抗原作用后的胚胎要用PBS中添加 并计数细胞。 1．5细胞计数 双重荧光染色后的胚胎在荧光显微镜下观察，可见到内细胞团细胞间连接比滋养层细胞连接紧 密，不易打破，内细胞团细胞仍是紧密的一团，因此把胚胎移到载玻片上时应尽量少带入液体或吸 掉大部分液体，利用液体的压力使胚胎铺展在载玻片上。使细胞球扩散避免重叠，便于观察计数。 在蓝色滤光片下内细胞团呈蓝色，滋养层细胞呈粉色。在绿色滤光片下内细胞团呈绿色，滋养层呈 红色。调节两种滤光片可观察到不同的染色效果。 1．6数据分析 采用DPS专业版统计软件对数据进行卡方独立性检验和方差分析。 2．结果 2．1抗血清的稀释度和作用时间 抗羊脾细胞抗血清的稀释度的筛选以l：5为最佳的稀释度。稀释