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酶学基础上的二元酸发酵工艺改进 肖云智焦鹏曹竹安 (清华大学化工系生物化工研究所，北京，100084) 摘要：奉文考察了烷烃的加^时间和加入量对细胞色素／)450薛的谤导厦产酸量的影响，提士7发 酵新工艺，即在开始上罐时并不加八烷烃，或加八少量的烷烃，使茸体得到快速的生长．进八指数 生长期后期加八烷烃谤早6—8小时后，再调节发酵体系的m值转^产畦期．实验结果表明：新 工艺在谤导P450酶及产酸量方面都优于旧工艺，新工艺条件下可将P450酶系诱导量提高14．56％， 产政量也提高7】4．15％． 关犍字长链二元酸热带摄丝酵母细胞色素P450烷烃 acid，I)CA)是一种重要的化工原料．是合成工程塑料、香料、耐寒性 长链二元酸(dicarboxylic 增塑剂、涂抖、液晶等物质的重要原料。目前主要利用热带假丝酵母(Candida tropticalis)转化 烷烃生产“-”。 热带假丝酵母转化烷烃生成长链二元酸的代谢途径为口，¨：烷烃被吸收进入细胞后。在微粒 体中被细胞色素P450酶n一氧化生成n一一元酵，a一一元醇再由醇氧化酶和醛脱氢酶氧化生成n 一一元酸，其中细胞色素P450酶是关键酶。a一一元酸再在相同酶系的催化下生成目的产物二元 酸(u一氧化)；细胞代谢过程中的n一一元酸以及二元酸都可毗经过B一氧化而消耗。 在以往发酵的过程中，通常在初始培养液中加入2％～5％的烷烃，并且有观点认为在发酵初 期加入高浓度的烷烃(大于5％)有利于产酸口]。但是考虑到菌体细胞在有蔗糖和烷烃存在的’情 况下，优先利用蔗糖生长，所以在细胞的生长期，烷烃对其生长并不是十分必要。相反高浓度的 烷烃对于菌体的生长有一定的抑制作用。而且有实验表明：适当提高细胞的培养液中糖类对烷烃 比例的对于产酸有一定的促进作用∞】。为此我们研究了在二元酸发酵过程中烷烃的加入时期对细 胞生长、P450酶的诱导和产酸的影响，井据此建立了长链二元酸新的发酵工艺。 1材料和方法 1．1菌种 清华大学化工系生物化工研究所保藏的热带假丝酵母(Candida tropliealis)CTI-12。 1．2培养基 0．01， 培养基组成如下(％)：蔗糖3，(NH。)2SO,0．05，玉米浆0．1．酵母膏0．1，维生素Bl NaCl 0．15，pH5．0；latm，灭菌20min。 0．4，尿素0．15，Mgsq．71120 0．1，I。j2P04 1_3培养及发酵 菌种从平扳上接入液体培养基中，根据实验要求加入不同浓度的烷烃．30C，200rpm，培养。 1．4分析方法 菌量及二元酸含量分析：参见文献[8]。 酶的活性．差值越大，说明P450酶活性越高。 2实验结果和讨论 2．1原有工艺的烷烃最优浓度 P450酶是烷烃代谢过程中的关键酶，提高P450酶的酶活及表达量对于产酸量的提高至关重 201 要，实验表明烷烃可以诱导P450酶的表达[91。我们考察了烷烃加入与P450酶的诱导之间的关系。 在培养液中直接加入同量的少量烷烃(2％，v／v)，培养一定时间(16～18小时)后补加入烷烃， 酶活达到最大值州)后下摇床，测量P450酶的诱导量。测量结果如下： 口H *码 霞 圉 筒 圜 一嚣S“憾删■■■_m? 鹚 霪 I： f‰¨ 《狂惭曲) 图l 烷烃加入量对P450酶的诱导的影响 图2 新旧工艺在诱导P450方面的对比 由图1可知。原工艺条件下(初始烷烃浓度为2％)，在烷