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蓝藻PEPC在大肠杆菌中的表达对脂类合成的调控+ 侯李君1，宋东辉1，施定基1·2，‘ (1天津科技大学海洋科学与工程学院，天津，300457 2中国科学院植物研究所，北京，100093) 摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPc(Ec4．1．1．31)是控制生物体内蛋白质和脂肪酸含量比 例的关键酶。本研究目的在于研究PEPc的表达对大肠杆菌西曲P—c^缸∞醐E．coh)中脂类合成 的调控。PCR法扩增了念珠藻Ⅳ口，foc印Pcc7120PEPc基因中含保守结构域的一段序列p印c， 并将其克隆到pMDl8．T载体上。将P印c基因片段正反向连接到穿梭表达载体pRL_489上 BamHI位点之间，构建得带有p印c正反义基因的载体pRL矗mp印c、pRL以月“p节c，转化人 大肠杆菌DH5a宿主细胞中。测定了转正反义基因菌株的PEPc活性，总蛋白和总脂。结果表 明：PEPc在大肠杆菌中的表达直接影响着PⅡ℃的活性和脂类的合成：PEPc的正向表达提高 了PEPc的活性，抑制了脂类的合成；哪c的反向表达减弱了P脚)C的活性(69．8％)，脂类 合成增加(49．6％)。 关键词：蓝藻；大肠杆菌；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPc)；反义表达；脂类 1前言 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPc；Ec4．1．1．31)是一种固定c02的酶，在Mg犄在下它催化磷酸烯 醇式丙酮酸PEP和HC03．反应生成草酰乙酸，并且释放Pi【“1。它广泛存在于光合作用生物中，如植物， 海藻，蓝细菌和光合细菌中，以及大多数非光合细菌中和原生动物中”】。 PEPc在细菌体内主要起填补作用，它能够补充被能量和生物合成代谢所消耗的碳，为维持三羧酸 循环起着重要的作用H，在大肠杆菌的代谢中占据着关键的位置”～。过去的十几年中，PEPc在大肠杆 01a0研究了PⅡ℃在大肠杆菌中的过 菌中表达的研究都围绕这一关键的作用展开。1993年，Yun．Peng 蛋白合成的作用，但是PEPc的表达对脂类合成影响的研究比较少。 在生物体的新陈代谢过程中，葡萄糖酵解产物丙酮酸有两个去向：一、在PEPc的催化下合成草酰 乙酸，进而生成天冬氨酸进入蛋白质代谢；二、在丙酮酸脱氢酶的作用下合成乙酰辅酶A，然后在乙酰辅 酶A羧化酶(Acc)的催化下生成丙二酸单酰辅酶A，进入脂类代谢。如果抑制了PEPC的表达，将会有更 多的丙酮酸用于合成脂类，蛋白质的合成即会减少。1999年，陈锦清等通过反义RNA的方法抑制了pepc 基因在油菜中的表达，得到了高产油油菜“””；2005年，赵桂兰等同样用农杆菌介导法将反义pepc基因 导人大豆的基因组，获得了稳定的超高油转基因大豆品系【】4；以上关于PEPC表达对脂类合成影响的研 究都基于真核生物，在原核生物中的研究则未见报道。但是我们研究集体首次在蓝藻中用反义RNA技术 和天津科技大学人才引进启动基金(N0_200604l”资助． 120 抑制谷氨酰胺合成酶转录水平上的表达，提高了蓝藻光台固氮后泌氨的效率。这为我们的研究奠定了理 论基础和技术手段。原核生物中蛋白含量较高，如果把合成蛋白的碳架转向合成脂类，对食品工业和能 源领域都有重要的意义，未来开发高油脂菌株的潜力很大。 本文报道了含pepc正反义基因载体的构建，以及转基因菌株的PEPc活性分析、总蛋白、总脂的测 定。 2材料和方法 2．1实验材料 2．1．1质粒、藻种和菌种 自TAKARA公司。 蓝藻：念珠藻7120(^b肋c华Pcc7120)来自中国科学院植物研究所 大肠杆菌(Dc船融缸．∞n，DH5a：购自1’AKARA公司，甘油保存 2．1．2试剂 DNA连接酶，各种限制性内切酶，DNA快速回收试剂盒均为TA瓦～RA公司产品；牛 ．T姻酶，T4 PcR引物合成及基因序列测定由上海生工公司完成。 2．2实验方法 2．2．1蓝藻与大肠杆菌的培养 下，液体培养时摇床转速为130r，Inill。 大肠杆菌DH5a以及转基因菌株培养于常规LB培养基中，37℃过夜培养，液体培养时摇床转速为 200r／lnin。 2．2．2基因的克隆与测序 序列(GenBank 酸，我们选择包含前一段保守结构域的片段p印c，即由起始