高密度发酵制备重组人OCIF活性域多肽融合蛋白.pdfVIP

I 高密度发酵制备重组人OCF活性域多肽融合蛋白，Ic 张兴群L2，王梁华2，焦炳华2，缪辉南2，袁勤生1 (第二军医大学基础医学部生物化学和分子生物学教研室，上海200433)2 (华东理工大学生物反应器国家重点实验室，上海200237)1 inhibitory 破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis OPG)可通过抑制破骨细胞形成、抑制成熟破骨细胞活性并诱导其凋亡实现对骨密度的调节，属于肿瘤坏 死因子受体超家族成员n一’。骨质疏松症、Paget’S病、癌症骨转移等导致的骨破坏都与破骨细胞分化 增殖异常活跃和骨吸收过量密切相关‘31，因此，OCIF研究将为这些骨骼类疾病H’51的预防和治疗提供帮 助。 本研究在获得OCIF活性结构域(OCIF柚)克隆与表达基础上，进一步考察了实现发酵罐高密度发酵表 达可溶性OCI‰融合蛋白的各种参数，实现了高表达。 1．材料与方法 I．I材料 1．1．1 菌株和重组表达质粒：大肠杆菌TBI由本室保藏。含有OCIK基因片段的重组质粒pMA卜 ocIF柚和工程菌株TBl／pMAl．—0CIF柚由本实验室构建。 1．1．2培养液：LB液体培养基1和2×YT液体培养基用作种子培养，半合成培养液用于发酵罐中 49，Na_HP04·12H20 的补料一分批培养。每L2×YT培养液含有蛋白胨169，酵母粉59，KFhP0429，K2HP04 79，(NH．)：SO,1．29，NH。C1 0．00 19，CaCl2·6H200．0049，Na2M004·2H200．0029，ZnCl20．0029，CuSO,·5}1200。0019，H3BO,0。00059， FeS04·7H20 0．029，CaCl2·2H200．029，MgSO。·7H200．39。每L补料基质中含葡萄糖2009，酵母粉709， p 蛋白胨709，MgSO··7Hz05．79。各培养液pH均调为7．0，加入氨苄青霉素至100g／mL。 I．2细菌培养方法 1．2．1种子液制备：选用新近转化和鉴定的菌种。挑取LB平板上单菌落接种于LB液体试管中，37 x ℃，220r／min振荡培养过夜。以5％接种量接入lOOmL2 YT培养液中，同上培养6h，为种子液。 1．2．2发酵罐中补料—分批培养：按发酵罐工作体积10％接入种子液，培养2～4h，饿∞达O．6’ 量和搅拌转速，控制溶解氧为30％～50％。 I．3分析方法 菌体2次，称量得菌体湿重。取不同‰。的菌液lOml，同上洗涤，105℃烘至恒重，称量得菌体干重。 ‰与菌体干重呈线性关系，一个单位觎∞约为干菌0．409／L，而lg湿菌体相当于0．29干菌体。 1．3．2 OCIF加融合蛋白表达量测定和纯化：蛋白质SDS—PAGE、Westernblot分析和直链淀粉树脂 亲和层析纯化均按文献[7]进行。Syngene凝胶成像系统扫描估算OCIF柚融合蛋白占菌体总蛋白的含量。 ·493· 同时取样按Bradford法测定蛋白含量。晟终平均值为每克干菌体相当于0 59蛋白质。 l 33 细胞后．离心弃上清．沉淀以M跚培养液(含10 细胞的培养板上培养。每2d换液50％，一周后将得到的破骨细胞(0c)定量接种于96孔细胞培养板上， (TRAP)活陛。 2结果 2 1 pMAL--OCIFAD重组表速质粒的构建和鉴定 PCR筛选、质粒取酶切鉴定、序列分析确证得到了无移码突变、阅读框正确的阳性重组表选质粒pMAL —0cIFu和基固工程茁株TBI／口MAL—0cI凡。 2 2补料一分批培养 麓