重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的纯度与分子量的测定.pdfVIP

重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的 纯度与分子量的测定 石磊’王研2李丽’刘志强’刘淑公’ 1.中国科学院长春应用化学研究所，长春130022;2.长春生物制品研究所，长春130062 4}-IruI〕 粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)是重要的造血调控因子’‘·’}，它主要来源于T 淋巴细胞，中性粒细胞，巨噬细胞，单核细胞。内皮细胞和纤维母细胞。重组人GM-CSF (rhGM-CSF)是利用基因工程生产的蛋白质，由于它的多种生物学活性，在临床上主要用于 白细胞减少症、骨髓异常增生症、再生障碍性贫血、肿瘤等3【·，。‘长春生物制品研究所应用 基因工程方法研制的分泌型rhGM-CSF具有天然结构和生物学活性[s1，中试产品进行了系统的 质量分析，并通过了技术成果鉴定。 巨文借助;质”助，光解吸质谱MAL‘DI-MS)一“强““的”析手段【”‘，以”子酸 (SA)作基质，对基因重组产物rhGM-CSF的纯度及分子量作了进一步的分析，获得了满意的 ， 结果，为中试产品的质量分析补充了更为可靠的数据。1 夕 1实验部分 1.1仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(BIFLEX-III,BrukerDaltonics,Inc.,USA), 氮气激光器，激光波长 337nm，脉冲宽度 3ns，质谱信号为单次扫描累加，加速电压为 19kV，以正离子谱侧定。基质为30mmo1/L芥子酸 (SA)，由美国AldrichChemical公司提 供.所用水为去离子二次重蒸水 1.2分子f的侧定 。重组rhGM-CSF样品由长春生物制品研究所友情提供.将待侧样品配成10mol/L的水 溶液，吸取10泌里于小塑料管中，再加入10泌基质混匀，取1泌此溶液滴于进样探头上， 抽空除去溶剂，使样品/基质混合物在探头上形成均匀的结晶，直接进样分析. 2结果和讨论 GM-CSF是一个具有激素样活性的塘蛋白，其基本肚链由127个氨基酸组成n，利用大肠 杆菌采用分泌表达技术得到的rhGM-CSF是无糖荃化的蛋白质，SDS银染法胶片用岛津 CS930双波长色谱扫描仪扫描对其纯度进行T分析，如图1A所示，经Westernblotting检 测，样品可见一条有良好特异性的免疫杂交带，见图IE。此时用芥子酸 (SA)作基质与样品 混溶进行MALDI-MS检测，进一步准诵测定了重组产物rhGM-CSF的纯度及分子量。 图1纯化后的rhGM-CSF纯度及特异性检侧结果 (SDS,Westernblotting) 图2为以芥子酸 ((SA)为荃质，rhGM-CSF的MALDI-MS谱图。从图2中可见，m/z14459 为rhGM-CSF的质子化分子离子峰，即[M+H]峰‘，分子离子峰最强的特征非常利于对样品分子 量的确认。m/27237对应于rhGM-CSF的二聚体峰LM+2H],谱图十分清晰，所有峰既能辨认 又易归属，显示了测定方法的准确性。图中基本没有杂质峰，进一步证明了样品的纯度。并 且此基因重组产物的一级结构是完全正确的，在表达、复性和纯化的过程中没有氨基酸的丢 失、变异和修饰。 相对丰度 图2rhGM-CSF的VALDI-TQF质讼图 (墓质:SA) 本实验对基因重组产物粒细胞一巨咙细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)进行了MALDI-MS检测. 得到了准确的分子量及纯度的信息。此方法具有测童精确度高、分析速度快、样品消耗贵少等特 点，是传统的方法无法比拟的。实脸结果为进一步研究开发这一基因重组产品提供了重要而准确 的信息。 今考文献 川 LopezA.F,，WilliamsonD.l.，GambleJ.R.，etal.,J.Clin.Invest.，1986,78:1220 [2)VisaniG.，TosiP.，FinelliC.,etal.，Haematological,1992,77(2):142 [31Jonesr.C.，BullcancerParis1991,78(12):1155 [41迟春萍，王研，刘淑玲等，中国生物制品学杂志，1999,12(4):24